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《吉林大学》 2011年
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蛋清源ACE抑制肽的结构鉴定及稳定性研究

于志鹏  
【摘要】:本研究为“863”计划项目(2007AAl0Z329)——“蛋清抗氧化肽与降压肽的生物制备技术”的子课题。本研究以蛋清蛋白为原料,建立制备蛋清源ACE抑制肽工艺模型,通过凝胶色谱分离结合四极杆线性离子阱串联质(QTRAP)谱确定蛋清源ACE抑制肽一级结构为RVPSLM, TPSPR, DLQGK, AGLAPY, RVPSL, DHPFLF, HAEIN和QIGLF,并获得高活性肽序列。本研究充分利用了QTRAP混合质谱的分离鉴定优点,阐明蛋清源ACE抑制肽纯化组分中的活性肽氨基酸序列。 1)在Cushman方法基础上进行改进,利用反相高效液相测定血管紧张素转化酶抑制肽活性。该方法具有试剂用量少且检测时间短等优点。反应条件为:30μL HHL底物液,加入20μL肽液混合均匀,在(37士0.5)恒温水浴中预热3--5min,然后加人10μL ACE液充分混合,37℃保温30 min后,再加人10gL的10%TFA终止反应,得到反应液,直接进行液相分析。 2)通过回归正交组合设计,蛋清蛋白质经碱性蛋白酶Alcalase酶解制备血管紧张素转化酶抑制肽。根据回归方程及西尔维斯特不等式求得极值点即最优酶解条件:底物质量分数为8%,酶解pH值为10.73,加酶量12%和酶解温度56.8℃。 3)蛋清降压肽的化学稳定性及抗胃肠道酶降解的能力进行了研究,结果表明蛋清蛋白质降压肽具有耐热性,在酸性和碱性条件下活性均很稳定,蛋清蛋白质降压肽的血管紧张素转化酶抑制活性受超声、光照和镁离子等因素影响不显著。蛋清蛋白质降压肽对胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性不强,分别经两种酶处理后降压肽活性明显下降。 4)利用凝胶色谱对蛋清蛋白质酶解液进行纯化,采用四极杆线性离子阱串联质谱得到19个活性肽离子峰,鉴定其中的活性肽序列分别为RVPSLM, TPSPR, DLQGK, AGLAPY, RVPSL, DHPFLF, HAEIN和QIGLF。该方法充分利用四极杆线性离子阱混合质谱的分离鉴定优点。 5)利用Fmoc肽固相合成方法对鉴定结构的活性肽的进行合成并测定其血管紧张素转化酶抑制活性。结果表明,蛋清源活性肽RVPSL和QIGLF具有较高的血管紧张素转化酶抑制活性,其半抑制浓度分别为20和75μM,其稳定性较好。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:TQ464.7

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