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《吉林大学》 2011年
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RNAi-Rac1对胆管癌治疗的实验研究

刘旭东  
【摘要】:胆管癌是病死率很高的恶性肿瘤,发病率占恶性肿瘤总数的2%,随着临床病理诊断认识不断更新,胆管癌的临床报道也逐渐增加。Racl是Rho家族中的GTPase是Ras超家族中的小分子G蛋白,它作为分子开关来调节细胞信号转导途径。Racl在许多重要的细胞活动中起作用,如参与基因转录、细胞周期过程的调控,并与细胞凋亡、肿瘤侵袭等密切相关。Racl在人类正常组织中低表达或者不表达,但在多种肿瘤组织及细胞系中高表达。 本实验通过检测Racl在胆管癌中的表达来探讨Racl在胆管癌的发生及发展过程中的作用。并应用miRNA技术靶向封闭Racl基因,观察在Racl基因被封闭后胆管癌细胞QBC939生长、增殖、凋亡、侵袭的情况。同时比较了miRNA技术靶向封闭Racl基因、单独应用环磷酰胺、单独应用氟尿嘧啶以及这三个因素两两组合后对胆管癌细胞QBC939增殖、凋亡的情况,从而为胆管癌的基因治疗寻找新的靶点,开辟一条新思路。 实验工作包括以下内容: 1.应用免疫组织化学SP法检测2007-2009年从内蒙古医学院附属医院搜集的患者组织标本中Racl蛋白的表达情况,其中胆管癌共74例,正常对照组17例。而在这74例胆管癌组织中,Racl在胆管癌组织中有不同程度的表达。三种已分化的胆管癌组织中Racl表达量明显高于正常组的表达量。在正常的组织中Racl仅见少量Racl棕色颗粒,而高分化的组织中Racl棕色颗粒较多,低分化组织中可见很多的明显的棕色颗粒,说明Racl在低分化的组织中有更多表达。可见Racl在胆管癌的的发生及发展过程中发挥重要作用,与恶性肿瘤的侵袭及转移有关,对Racl检测有助于胆管癌生物学行为的预测和预后的评价。 2.应用分子生物学技术,模拟内源性miRNA,设计靶向封闭Racl基因的miRNA。然后应用脂质体2000转染胆管癌细胞QBC939,倒置荧光显微镜观察转染效果,用G418筛选转染胆管癌细胞QBC939,24 h后在Racl封闭细胞和空质粒细胞中能见到明显的绿色荧光,而在空白组中则没有。从而获得稳定转染的细胞系。在此基础上,应用实验RT-PCR检测转染后Racl在mRNA的水平的表达情况,应用Western-blot检测转染后Racl基因的蛋白表达水平,Racl封闭细胞中的Racl的表达量减少,说明细胞筛选成功。构建了Racl被封闭的细胞系。为进一步研究其在胆管癌中的作用奠定了基础。 3.通过荧光定量PCR和Western blot得到Racl封闭组Racl的表达量明显低于空质粒组和空白对照组(P0.05)。MTT分析得到,Racl封闭对QBC939细胞生长的抑制率可达28.53±0.50%,明显高于其他两组(P0.05)。经过流式细胞仪检测Racl封闭组的细胞在S期的明显减少(P0.05),而G2/M较多(P0.05)。而Racl封闭组细胞的凋亡率也是最高。通过Transwell实验,可见Racl封闭组的穿膜细胞数明显低于其他两组(P0.05)。Racl在细胞QBC939的生长进程中发挥重要作用,在其活动中起到分子开关的作用,与其生长、增殖、凋亡、过程及侵袭、转移能力密切相关。 4.应用实时定量PCR和Western blot对靶向封闭Racl基因与化疗药处理胆管癌细胞QBC939 Racl表达进行了测定,结果空白对照组、氟尿嘧啶和环磷酰胺组的Racl表达量明显高于Racl封闭组;而环磷酰胺+氟尿嘧啶,环磷酰胺+Racl封闭组和氟尿嘧啶+Racl封闭组中,后两组的Racl的表达量较低(P0.05)。用MTT法检测胆管癌细胞增殖抑制情况,单独应用化疗药环磷酰胺、氟尿嘧啶,或者单独应用Racl封闭处理,Racl封闭对胆管癌增殖的抑制率在测试的三个时间段均不及化疗药作用。而联合用药的结果发现,联合应用两种化疗药同单用药物相比抑制率变化不大。然而,将化疗药与Racl封闭处理联合应用对胆管癌细胞的抑制作用大大提高,而且随着作用时间的增加,到作用72 h后达到最大,接近完全抑制细胞的增殖。流式细胞仪测结果也证实了此结果。若单独用药,环磷酰胺和氟尿嘧啶对细胞QBC939的生长抑制情况较好;当基因疗法与药物治疗联合应用时,则是有RNAi参与的组全部较单用化疗药好,说明可能联合治疗效果要比单独用药强。 从实验中我们发现,Racl在胆管癌细胞QBC939的生长、增殖、凋亡过程及侵袭、转移中均起着重要的调控作用。应用RNAi技术使Racl沉默后可有效促进胆管癌细胞凋亡,同样也能够抑制该细胞的侵袭和转移。虽然实验中我们发现该基因治疗的方式不及化疗药作用强,但RNAi-Racl联合化疗药的治疗方法可以得到更好的治疗效果。因此,应用基因治疗技术或联合化疗药抑制Racl的表达可能成为胆管癌治疗的新思路。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R735.8

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