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《吉林大学》 2011年
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猪血凝性脑脊髓炎免疫层析检测试纸及其灭活疫苗的研制

陈克研  
【摘要】:猪血凝性脑脊髓炎是由血凝性脑脊髓炎病毒(hemagglutinating encephalomyelitis virus, HEV)引起仔猪的一种急性、接触性传染病。HEV属于冠状病毒属成员,其主要侵害1-3周龄的仔猪,临床上以仔猪呕吐、衰竭和明显的神经症状为主要特征,死亡率达20-100%。1962年,该病原从加拿大患脑脊髓炎的哺乳仔猪体内首次分离获得。1972年,比利时人Pensaert MB从暴发“呕吐和衰竭”症状,而未出现“脑脊髓炎”神经症状的死亡猪扁桃体中分离获得HEV-VW572毒株。以后,世界上许多国家均有该病的报道,尤其以日本、加拿大等国家危害比较严重。血清学调查显示,猪感染HEV非常普遍,且呈世界性分布,大部分被感染的猪处于亚临床状态,一旦发病,将给养猪业造成巨大的经济损失。目前,常规的HEV检测技术主要有病毒分离鉴定、RT-PCR、巢式PCR、血凝/血凝抑制试验(HA/HI)、血清中和试验(VN)等方法。但这些检测方法大多需要专业的技术人员、特定的操作环境以及一些特殊的仪器设备,不适合基层现场检验工作的需要,满足不了该病暴发流行时紧急应对的要求,所以在一定程度上限制了其在兽医临床诊断中的应用。因此,开发一种操作简单、使用方便快捷的HEV检测方法对于基层兽医工作者十分必要。 近年来,随着单克隆抗体(McAb)技术的发展与成熟,其在分子生物学、免疫学、生物化学、遗传学等许多领域得到了广泛的应用,许多疾病诊断和鉴别诊断方法的建立都与McAb有关。本研究应用蔗糖密度梯度离心法纯化HEV,免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA筛选杂交瘤细胞,获得4株稳定分泌抗HEV的单克隆抗体,分别命名为2H2、2A1、1E2、4D4。经鉴定,4株McAb的ELISA效价在1:12800~1:51200之间;亚类鉴定证实,除1E2为IgG2a外其余3株单抗均为IgGl;Western blot分析表明,2H2、1E2和4D4能识别HEV的血凝素-酯酶蛋白(HE),2Al可识别纤突蛋白(S);经间接ELISA及间接免疫荧光鉴定,4株单抗均能与HEV结合,其特异性良好;用单抗2A1和2H2建立检测HEV的双抗体夹心ELISA方法,最低可检测3.75μg/mL的病毒,且与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(HCV)及牛冠状病毒(BCV)等无交叉反应,说明该方法可用于HEV的检测。 胶体金免疫层析技术(Gold Immunochromtographic assay, GICA)是将免疫胶体金技术(Immunogold labeling technique)与层析法结合,以胶体金作为标记物,应用于抗原与抗体之间反应的一种新型检测技术。将McAb与GICA结合制备的胶体金检测试纸条具有操作简单快速、检测结果清楚易于判断、特异性强、敏感性高、无需仪器设备或只需简单的仪器等优点,因此非常适于发病现场、门诊以及实验条件不具备的场所使用,在医学和动物医学检疫、检验等方面已被广泛应用。本实验在成功制备HEV单克隆抗体的基础上,结合胶体金免疫层析技术研制检测HEV的胶体金免疫层析试纸条。首先应用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,经电镜观察胶体金颗粒大小在30nm左右;通过梯度法确定McAb与胶体金结合的最佳pH值为8.5,最佳结合浓度为37μg/mL;将制备好的金标单抗包被玻璃纤维膜,另一株McAb及羊抗小鼠IgG分别喷点硝酸纤维膜(NC膜)检测线和质控线,组装试纸条。用该试纸条检测不同浓度的HEV,结果最低可检测30μg/mL的病毒;特异性实验结果表明该试纸条在检测TGEV.PEDV.PRV、HCV.BCV及MHV等病毒时不发生交叉反应;分别用试纸条.RT-PCR及ELISA方法对50份临床样本做平行检测,结果试纸条与RT-PCR和ELISA的符合率为98%,其Kappa值为0.956,说明本实验研制的试纸条可用于临床HEV的检测。 应用胶体金免疫层析技术研制检测HEV血清抗体的胶体金免疫层析试纸条,首先将兔抗猪IgG标记胶体金包被玻璃纤维膜,然后用喷点仪将纯化的HEV和羊抗兔IgG分别喷点于NC膜的检测线和质控线,组装成试纸条。用该试纸条分别检测HEV、TGEV、PEDV、PRV、HCV及BCV的阳性血清并用其检测不同HI抗体效价的HEV阳性血清,结果试纸条仅对HEV阳性血清检测时,在检测线及质控线出现清晰的红色条带,且最低可检测HI效价为21的HEV阳性血清,说明试纸条具有很好的特异性和敏感性;用同一批次和不同批次的试纸条检测HEV阳性血清,结果试纸条批内重复及批间重复差异不大,变异系数为0.82%,证明试纸条重复性较好;保存期试验证明该试纸条4℃保存12个月,其特异性和敏感性均未发生变化,说明试纸条具有很好的稳定性;分别用试纸条、ELISA及HI试验对50份临床血清样本进行检测,评估试纸条与二者的相关性。结果试纸条与ELISA的符合率为98%, Kappa值为0.953;与HI试验的符合率为96%,Kappa值为0.911,说明试纸条可代替ELISA和HI试验用于临床血清样本检测。应用本实验室研制的试纸条对吉林省及辽宁省部分地区进行HEV的血清抗体调查,结果672份血清样本中,有334份呈阳性,总阳性率为49.7%,提示被检测地区的猪群中普遍存在HEV感染。 目前,HEV的暴发呈上升趋势,且未见有关预防或治疗HEV的特效药物或疫苗的研究报道,仅在国外部分国家应用“亚感染”进行预防,即在母猪临产前一个月与病猪接触或喷雾或肌肉注射培养的弱毒,使母猪获得免疫,进而通过初乳中的抗体保护后代仔猪,使其不表现临床症状,而这些猪大多呈亚临床感染,且此种免疫方法存在着散毒的危险。因此,研制高效安全的疫苗对HEV的防治有重要的现实意义。本试验选用HEV-67N标准毒株作为疫苗研制的候选毒株,通过优化体外培养条件,确定HEV-67N在PK-15细胞上培养传代,并建立PK-15细胞的原始种子细胞库(123~126代细胞)、基础种子细胞库(127~136代细胞)和工作种子细胞库(137~141代细胞);同时分别建立HEV-67N原始种子病毒库、基础种子病毒库和工作种子病毒库;随机抽取细胞库及病毒库中的细胞和病毒,通过镜下观察、无菌检验、支原体检测及核酸分析等检测均符合“兽用生物制品质量标准”;然后在筛选出优良佐剂的基础上,取工作种子病毒库的病毒液,经4%o甲醛灭活后,按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》规定,将氢氧化铝胶佐剂和灭活的病毒按1∶9比例混匀,制备HEV细胞培养灭活疫苗。随机抽取实验室制备的疫苗以不同剂量接种Balb/c小鼠和怀孕母猪,结果该疫苗除了可以诱导良好的特异性免疫应答外,不产生任何临床副作用,说明本疫苗对小鼠和怀孕母猪是安全有效的;对注射疫苗后产生不同抗体效价的Balb/c小鼠进行脑内攻毒,结果当小鼠HI抗体效价≥25时,其保护率可达80%以上,且HI抗体效价滴度与免疫攻毒试验间存在良好的平行关系,可代替常规的攻毒保护率试验;将HEV灭活疫苗免疫Balb/c小鼠,结果小鼠经3次免疫后,HI抗体效价最高达29,进而通过血清亚类鉴定、淋巴细胞增殖实验、细胞因子检测等方法证实,该疫苗可刺激小鼠产生特异性的体液免疫应答,且以Th2型免疫应答为主;最后对疫苗的保存期进行评定,疫苗在2~8℃和室温(13℃~28℃)分别保存至12个月和4个月时,其物理性状及免疫效力未见变化,这与灭活疫苗稳定、便于保存运输的特点基本一致。由此可见,本实验制备的HEV灭活疫苗可安全有效的刺激机体产生特异性免疫应答,仔猪可通过经疫苗免疫的怀孕母猪产生HEV抗体,从而达到预防该病的目的,该疫苗的研制对HEV的防治有重要的现实意义。
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