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《吉林大学》 2011年
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蛋白质工程和溶剂工程改变嗜热酯酶的底物特异性和活性

刘畅  
【摘要】:来源于超嗜热古菌Aeropyrum pernix K1酰基氨酰肽酶(APE1547)是具有酰基肽酶/酯酶等活性的多功能(promiscuous)酶,具有超常的生物学稳定性。本课题组在前期研究中,通过定向进化的方法,获得了酯酶活性提高的突变体P01(R526V),对系列对硝基苯酚酯底物表现良好的酯酶水解活性,最适酰基链长底物为对硝基苯酚辛酸酯(pNP‐C8)。本文结合定向进化与半理性设计的蛋白质工程方法和溶剂工程技术,增加该酶对长链酰基底物的活性和选择性,并对酶活性和底物选择性与酶细微结构之间的关系进行了深入的分析。采用的研究方法和取得的结果如下: 1、以P01为出发酶,应用非理性的定向进化方法,对其催化结构域基因进行易错PCR后与推进器结构域连接,转化BL21菌,在多重选择压力下(高温及不同长度碳链的底物),应用优化的高通量筛选方法,筛选了万余株突变体,发现1个远离活性中心18.2(?)的关键位点T560,得到突变体E01(R526V/T560W)。催化动力学分析发现:E01对pNP‐C12的亲和力(1/K_m值)是P01的9.7倍,转化数(kcat值)是P01的1.5倍,因此催化效率(k_(cat)/K_m值)是P01的14倍,表明对底物特异性的提高主要的原因是提高了对pNP‐C12的亲和力。将P01分子与不同链长底物作模拟通道对接(SLITHER),发现T560位于次要底物通道的入口处,突变为W后,通道变得狭窄,阻碍了pNP‐C12的进入。结构分析表明,酶的推进器结构域中以及推进器结构域与催化结构域之间存在两条通道,推测由于改善了pNP‐C12在酶分子内部的交通,而使催化效率明显提高。此外,T560W突变使酶的80℃半衰期由123小时下降为77小时(酶浓度0.8mg/ml)。结构分析表明,Thr560的侧链O与563的主链NH之间形成氢键对局部构象的稳定性有重要作用,突变破坏了这一氢键,可能是热稳定性下降的原因之一。 2、以E01为出发酶,根据底物与E01活性中心的分子对接结果,应用半合理设计的方法,选择11个底物结合部位的残基(3个活性位点附近残基Y444、Y446、Y449和8个底物口袋处的残基P370、E419、W474、M477、F485、F488、I489、T527)进行饱和突变,在多重选择压力下(高温及不同长度碳链的底物)的高通量筛选,发现了2个关键位点W474和F488,对酶的酰基链长选择性和活性有显著影响。并获得3个突变体:S01(F488G/R526V/T560W)、S02(F488P/R526V/T560W)和S03(W474V/R526V/T560W)。它们对pNPC12的k_(cat)/K_m值分别是P01的4.5、4.6和21倍,k_(cat)值分别是P01的3、1.5和4倍。 应用同源模建和底物对接,对F488和W474位点影响底物选择性和活性的机制进行了分析。F488位点位于底物结合口袋的侧壁,突变为G后,底物结合口袋体积扩大为577(?)~3,推测更利于容纳长链酰基;W474位点位于底物口袋的底部,突变为V后,底物结合口袋的深度由6.07(?)延长为11.4(?)左右,同时该口袋的疏水性增强,有利于长链酯底物的进入与定位,因而提高了活性。为证实结构分析的合理性,通过理性设计,分别获得了E01基础上的突变F488→S、A、Y、W和突变W474→A、Q和双点突变W474V/F488G连同饱和突变筛选得到的F488G、F488P和W474V共12种突变体酶,分别测定催化动力学参数,与相应氨基酸侧链理化性质作二维构效分析,其结果支持结构分析的结论。理性设计得到的D01(W474/F488G/ R526V/T560W)性质最优,对pNPC12的k_(cat)/K_m值是P01的24倍,k_(cat)值是P01的5倍。 3、溶剂工程是通过改变介质环境来达到调节酶活性和底物选择性的重要技术。选择乙腈、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺作为研究对象,分别建立了反应体系,研究了野生型酶和各种突变体在水/有机共溶反应体系中对不同底物的催化反应,发现三个带有F488G和W474V的突变体在低浓度有机溶剂中的催化特征与WT、P01和E01存在显著的不同。随着有机助溶剂浓度的提高,S01、S03和D01的活性有明显的提高,而WT、P01和E01的活性却受到强烈的抑制。在10%乙腈、30%二甲基亚砜和20%二甲基甲酰胺中,最佳突变体D01与WT相比,活性分别提高240倍、99倍和280倍。有机溶剂对S01、S03和D01的底物选择性也有明显增强,其中最佳突变体D01在10%乙腈、30%二甲基亚砜和20%二甲基甲酰胺中,对pNPC12/ pNPC4的选择性增加了12、18、和19倍。 分析发现酶在乙腈溶剂中的C_(50)与F488残基的疏水性参数呈正相关性(R~2=0.946)。在10%乙腈中的模拟分子动力学也发现乙腈分子可以渗透进入活性中心,而且突变后的G488附近有乙腈分子留滞的现象。推测该激活现象是由于有机溶剂分子渗入酶活性中心,进入了F488G和W474V突变产生的空穴,使催化部位的微环境发生改变,因而改变了酶的催化效率。 本论文对酶本身及酶反应溶剂体系的优化进行了系统的探索。研究表明:1、APE1547对酯底物的选择性与底物通道、底物结合口袋关键氨基酸理化性质、催化中心的微环境密切相关。2、酶的分子改造与溶剂工程相结合,是改变酶底物选择性的有效手段,对酶分子改造和应用具有很好的借鉴意义。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q55

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【参考文献】
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 王秋岩;蛋白质半合理设计改变古菌Aeropyrum pernix K1酰基氨酰肽酶/酯酶的底物特异性[D];吉林大学;2006年
2 张桂荣;嗜热酯酶APE1547的立体选择性研究[D];吉林大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 张爱军;超嗜热酯酶APE1547突变体的结构和酶学性质的研究[D];吉林大学;2005年
2 王莹;溶剂效应的量子化学研究[D];四川大学;2006年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 邹义英;谭贤勇;李军生;;酶催化合成蔗糖酯研究进展[J];食品科学;2007年07期
中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 郝朝瑜;煤的芳香性及氢键对钙基阻化剂抑制煤自燃作用的理论研究[D];辽宁工程技术大学;2010年
2 金鑫;脂肪酶催化芳基丙酸酯水解立体选择性调控方法[D];浙江大学;2011年
3 郑逢春;有机相纳滤传递机理的研究[D];北京化工大学;2009年
4 程学礼;硅、铝醇盐水解聚合机理的理论研究[D];山东大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前7条
1 袁鹏;分子模拟辅助研究脂肪酶的对映体选择性及构象变化[D];浙江大学;2011年
2 陈雄飞;酶催化3-TBDMSO戊二酸单甲酯不对称合成的研究[D];天津大学;2010年
3 江雪青;皱褶假丝酵母(Candidarugosa)脂肪酶基因的克隆与表达[D];华中科技大学;2009年
4 刘波;溶液结构和热力学性质的RISM理论和量子计算[D];北京化工大学;2011年
5 刘小文;溶剂效应对CS_2的v_1-2v_2费米共振的影响[D];吉林大学;2010年
6 李聪;分子动力学模拟研究脂肪酶的催化机理[D];北京化工大学;2010年
7 陈兴莉;离子及高温高压对溶液体系的影响[D];合肥工业大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 朱国萍;用蛋白质工程方法设计和改造工业用酶[J];安徽师大学报(自然科学版);1998年04期
2 王智,苟小军,曹淑桂;脂肪酶在生物化工中的应用[J];成都大学学报(自然科学版);2003年01期
3 崔玉,杨军,孙萍,王全立;酶的体外定向进化策略研究进展[J];国外医学.遗传学分册;2005年05期
4 蔡灵仓,陈其峰,经福谦,陈栋泉;高密度氦状态方程的分子动力学模拟研究[J];高压物理学报;1999年04期
5 林影,卢溁德;极端酶及其工业应用[J];工业微生物;2000年02期
6 周丽萍,周政,袁中一;巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的定点突变及其动力学性质研究[J];工业微生物;2003年01期
7 蒋华良,陈凯先,嵇汝运;溶剂效应量子化学研究进展[J];化学通报;1995年04期
8 张红缨,孔祥铎,张今;蛋白质工程的新策略——酶的体外定向进化[J];科学通报;1999年11期
9 王萍;脂肪酶专一性在脂质生物转化中应用前景[J];粮食与油脂;1998年02期
10 吴华昌,邓静,吴晓莉,韩莎;蛋白质工程在改造工业用酶中的应用[J];四川轻化工学院学报;2004年02期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 邹建卫;药物分子设计中溶剂效应的量子化学研究及应用[D];浙江大学;1999年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 吴华昌,邓静,吴晓莉,韩莎;蛋白质工程在改造工业用酶中的应用[J];四川理工学院学报(自然科学版);2004年02期
2 张红缨,孔祥铎,张今;蛋白质工程的新策略——酶的体外定向进化[J];科学通报;1999年11期
3 张秀艳;何国庆;;蛋白质突变体基因库构建方法的研究进展[J];中国生物工程杂志;2006年10期
4 ;蛋白质工程实验指南[J];应用与环境生物学报;2011年02期
5 黄奋飞;赵菁;林生;林文雄;;纤维素酶的蛋白质工程改造的研究进展[J];安徽农学通报(上半月刊);2011年15期
6 ;科学出版社新书[J];中国生物工程杂志;2011年03期
7 孙立水;高强;李荣勋;;酯酶和脂肪酶对映选择性的改进技术[J];化工技术与开发;2008年02期
8 张作良,王凡业,刘均洪;利用工程酶改进有机合成的研究进展[J];上海化工;2005年08期
9 孙志浩,柳志强;酶的定向进化及其应用[J];生物加工过程;2005年03期
10 吴振芳;陈惠;曾民;吴琦;;蛋白质新功能定向进化研究策略[J];生物技术通报;2009年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 袁静明;石亚伟;郭晨云;李卓玉;;蛋白质自剪接及其在蛋白质工程中的应用[A];2004年全国生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
2 张光亚;葛慧华;方柏山;;木聚糖酶氨基酸组成与其最适温度的主成分分析-神经网络模型[A];中国生物工程学会第四次会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2005年
3 周亚凤;张先恩;;分析用酶的分子操纵[A];廿一世纪微生物学发展前沿与应用新技术研讨会论文摘要集[C];2003年
4 吴松刚;柯崇榕;江贤章;黄建忠;;工业微生物分子育种的技术路线及实例[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2009年学术交流会论文摘要汇编[C];2009年
5 郭宁;沈倍奋;;分子进化在蛋白质工程中的应用[A];山东免疫学会、山东微生物学会医学微生物学专业委员会、山东省医学会微生物学和免疫学专业委员会、山东省医药生物技术学会2001年学术年会论文汇编[C];2001年
6 王慧荣;;一株嗜热菌的分离和鉴定[A];广西微生物学会2003年学术年会论文集[C];2003年
7 苟小军;;大肠杆菌海藻糖-6-磷酸合成酶/水解酶操纵子的定向进化[A];新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展(上册)[C];2001年
8 苏龙;韦宇拓;黄日波;;嗜热菌的分离与鉴定[A];广西微生物学会2003年学术年会论文集[C];2003年
9 汪浩;李宇驰;陈晔;洪星;段举;李涛;王敬强;殷剑宁;刘斯奇;;腾冲嗜热菌蛋白质组数据库(TPB)的开发与利用[A];中国蛋白质组学首届学术大会论文摘要集[C];2003年
10 林章凛;;分子定向进化的最新进展[A];代谢工程和工业生物技术研讨会论文集[C];2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 北京大学生命科学学院 顾孝诚;话说蛋白质工程[N];科技日报;2002年
2 张冰;品牌战略,请多一份理性设计[N];厂长经理日报;2000年
3 秦宜德、李昱;综合各种因素 理性设计城市[N];中国房地产报;2003年
4 舒圣祥;民族图腾岂能“理性设计”[N];福建日报;2006年
5 舒圣祥;民族图腾岂能进行“理性设计”[N];检察日报;2006年
6 肖苑玫;中国队理性设计备战环节[N];中国体育报;2007年
7 娄立平、郑极;城市建筑需要理性设计者[N];中国房地产报;2004年
8 本报记者 卢飒;填补我省“空白”[N];贵阳日报;2007年
9 贺鹏;鳗鱼药残控制技术研究取得突破[N];福州日报;2008年
10 记者 李琦琨;蛋白质工程实验室成立填补我省产业研究空白[N];经济信息时报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘畅;蛋白质工程和溶剂工程改变嗜热酯酶的底物特异性和活性[D];吉林大学;2011年
2 胡升;面向靛玉红生物制备的细胞色素P450 BM-3半理性定向进化[D];浙江大学;2010年
3 王跃溪;理性设计提高嗜热酯酶对有机磷化合物的敏感性[D];吉林大学;2012年
4 詹冬玲;超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3半胱氨酸蛋白酶的研究[D];吉林大学;2011年
5 徐涛;基于分子模拟的脂肪酶LipK107结构与功能关系研究及理性设计[D];华东理工大学;2011年
6 杨广宇;利用定向进化提高酰基肽水解酶及糖基转移酶的催化活力[D];吉林大学;2009年
7 赵洪亮;人睫状神经营养因子的蛋白质工程研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
8 陈世琼;浓缩苹果汁生产过程中嗜酸嗜热菌的分离及相关生物学特性研究[D];中国农业大学;2005年
9 于珊珊;重组嗜热闪烁杆菌脂肪酶系的性质表征及嗜热磷酸三酯酶晶体结构解析[D];吉林大学;2010年
10 秦玉琪;瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅱ蛋白质工程改造和表达研究[D];山东大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 田国贺;应用蛋白质工程技术改变嗜热酯酶的底物选择性[D];吉林大学;2009年
2 韩蕴琪;蛋白质半理性设计提高Candida Rugosa Lipase 1的热稳定性[D];吉林大学;2011年
3 吴秀秀;Bacillus subtilis 168β-1,4-内切木聚糖酶胰蛋白酶抗性的理性设计[D];暨南大学;2012年
4 万佩;嗜热蛋白模块酶合理化设计与模块重组[D];吉林大学;2011年
5 王靖凯;嗜热乙醇杆菌遗传转化技术的研究[D];南京师范大学;2011年
6 张达;草菇糖苷水解酶家族5纤维素酶的定向改造[D];南京林业大学;2011年
7 王慧荣;一株新型嗜热菌TTH的分离、鉴定及其质粒的研究[D];广西大学;2004年
8 王中禹;嗜热酯酶APE1547催化结构域的克隆、表达及性质测定[D];吉林大学;2008年
9 朱珊珊;华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶底物特异性的定向改造[D];江南大学;2012年
10 刘艳莉;利用蛋白质半理性设计提高超嗜热酯酶APE1547的活力[D];吉林大学;2006年
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