收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

褶皱假丝酵母脂肪酶热稳定性改造的设计与抗氧化酶的人工模拟

高楠  
【摘要】:酶以其高效、专一和环境友好等特点,越来越广泛的被应用于人类生活的各个领域。但同传统的化学催化剂相比,酶分子的稳定性作为一项重要性质,对酶催化功能的发挥有着重要的影响。可是,由于酶的稳定性往往受到诸多因素的共同影响而决定,因此对于酶稳定性的改造一直是生物学和化学领域的难点。随着分子生物学和结构生物学等学科的不断进步,对于酶稳定性的定向进化和合理设计以及人工模拟酶的设计和构建已经逐步发展为酶工程领域针对酶稳定性研究的两个重要前沿方向。本论文将从以上两方面入手分别进行褶皱假丝酵母脂肪酶的热稳定性改造和抗氧化酶的人工模拟的研究。 论文第一部分选取来源于褶皱假丝酵母的脂肪酶1 (Candida Rugosa lipase 1, CRL1)作为研究对象,利用分子生物学手段对其进行了热稳定性的改造。作为目前在国际酶制剂市场中占有较大份额的商业脂肪酶CRL的主要成分之一,CRL1具有非常广泛的应用性和市场前景。但由于来源于常温微生物,其最适反应温度仅为40℃,热稳定性很差,50℃条件下的半衰期不超过一个小时,80℃条件下几乎立即失活。较差的热稳定性已经阻碍了CRL1在工业生产中的进一步应用。 由于Candida rugosa遵循一套非通用的密码子系统:即将密码子CTG编码为丝氨酸,而在通用密码子系统中是编码为亮氨酸的,这其中还包括Lip1的催化中心209位的丝氨酸,所以在前期研究中,需要将基因中的19处CTG突变为TCT.随后利用毕赤酵母工程菌GS-115异源表达Lip1,纯化之后经SDS-PAGE检测得到了分子量与天然Lip1一致的纯化重组蛋白。对重组Lip1的酶学性质进行了测定,结果显示重组的Lipl的最适温度(40℃),45℃时的活力降为最适温度时的70%,最适pH (pH7.5)和动力学参数(kcat、Km)均与天然酶一致,证实了异源重组表达Lip1的正确性。 传统的热稳定性改造主要有“定点突变”和“定向进化”两种手段,“定点突变”的工作量小,但是它的难点在于突变位点的准确预测;而“定向进化”虽然无需对突变位点进行准确预测,但是它需要构建一个很大的突变库,进行多轮的筛选,工作量很大。为了解决上述问题,在这部分实验设计中,我们引入了一个晶体学中的参数B因子(B-factor),它表示了原子电子密度的可散播性,并且可以影响晶体中蛋白质分子的结构特征。B值越大的原子就拥有越大的灵活性。 针对前人的研究成果,我们提出了本实验突变位点的选择标准。首先,为了保证突变体的最适温度上升,所选的突变位点需要位于蛋白的内部,所以所选突变位点与催化中心氨基酸的距离要小于10A;其次,根据Kazlauzkas规则,改变与催化中心的距离小于5A的氨基酸,会对酶的催化行为产生明显的影响。而由于野生型酶的催化性质已经非常优秀,在改造的时候需要尽量保留野生型的催化性质,所以所选突变位点与催化中心氨基酸距离又需要大于5A:最后,由于蛋白质内部氨基酸的B因子值一般会比较小,但是根据现有文献,B因子需要≥(蛋白中最大的3个B因子的平均值)/2才具备改造的意义。 本着上述原则,我们预测出GLU 126与LEU 302可能是提升CRL1稳定性的关键突变位点。下一步的工作将利用定点饱和突变的方法对这两个位点分别进行了突变,筛选得到了热稳定性上升的突变体。 论文的第二部分针对生物酶分子稳定性低、来源有限等特点,着重应用化学方法以小分子有机化合物作为模拟物,人工模拟具有谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)与过氧化氢酶(CAT)等天然抗氧化酶活性的有机小分子模拟酶。本研究首先对天然GPX的稳态和预稳态的动力学行为进行了研究,得出了模拟物对过氧化氢的结合能力才是影响模拟物活力的最主要因素。并以此为基础,以对底物过氧化氢的结合能力最好的小分子模拟物为母体,用化学合成的方法获得一种新型的GPX模拟物Mn(III)2(L-Se-SO3Na),并利用质谱、红外光谱、核磁共振及元素分析等手段证明了模拟物结构的正确性。 通过测定我们发现,模拟物的GPX活力为5.6±0.3 U/μmol,已经达到经典小分子模拟物PZ51 (Ebselen)活力的5.66倍。Mn(III) 2(L-Se-SO3Na)的SOD和CAT活力分别为138.9±1.2 U/μmol、75.0±2.3 U/μmol,实现了将生物体内三种最重要的抗氧化酶活力统一于同一个小分子模拟物中。模拟物Mn(III) 2 (L-Se-SO3Na)的稳态动力学结果显示Mn(III) 2 (L-Se-SO3Na)的表观二级速率常数kcat/KmH2O2和kcat/KmGSH分别为1.14E+07M-1min-1和1.00E+06M-1min-1,明显高于一般的小分子模拟物,成功实现了模拟物对H202的结合能力大于对GSH的结合能力的设计目标。而且Mn(III) 2 (L-Se-SO3Na)的kcat/KmH2O2与kcat/KmGSH之间的比值已经非常接近天然GPX的比值,进一步证实了模拟物拥有与天然酶相类似的动力学行为。牛心线粒体构建的氧化损伤模型进一步证实了模拟物Mn(III)2(L-Se-SO3Na)具备良好的抗氧化损伤的能力。 以上结果表明,我们成功建立了一种新型的谷胱甘肽过氧化物酶模拟物的设计策略,设计并合成了一种同时具备GPX、SOD和CAT三种抗氧化酶活力的新型小分子模拟物Mn(III)2(L-Se-SO3Na)。这些研究为多功能模拟酶的设计和合成奠定了理论基础。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 钱俊青;蒋盛蓝;秦德怀;郭辉;凌春英;;214型离子交换树脂固定化假丝酵母脂肪酶的研究[J];浙江工业大学学报;2013年03期
2 徐启峻;滕宏飞;黄程;赵玉谨;罗红宇;;一株柱状假丝酵母产脂肪酶条件的优化研究[J];中国油脂;2015年05期
3 陈林林;辛嘉英;张颖鑫;张帅;;粗状假丝酵母产脂肪酶发酵条件的优化[J];食品工业科技;2010年01期
4 陈贵佺;郑二丽;;褶皱假丝酵母脂肪酶催化反应条件的研究[J];现代食品科技;2013年04期
5 董恒涛;吴晓英;;粗状假丝酵母脂肪酶的分离纯化及水解乳脂的初步研究[J];食品科技;2010年03期
6 张玉芳;单守水;;褶皱假丝酵母产脂肪酶条件及酶学性质研究[J];食品研究与开发;2014年05期
7 张健;郑来久;薛永常;;解酯假丝酵母脂肪酶的性质及固定化[J];大连工业大学学报;2013年01期
8 董恒涛;吴晓英;刘仁春;林影;;假丝酵母脂肪酶催化底物水解的初步研究[J];现代食品科技;2008年07期
9 熊杰;张亚平;胡文革;李扬;王仿;;粗状假丝酵母产酶能力及发酵条件的优化[J];湖北农业科学;2009年03期
10 肖海群;段学辉;牛春铃;;粗状假丝酵母(Candida valida T2)生产脂肪酶的发酵条件[J];食品与生物技术学报;2007年04期
11 向丽;李蓉;周铁军;叶迎春;王光西;;五倍子鞣质对生物被膜型白假丝酵母的干预作用[J];安徽农业科学;2012年27期
12 王慧;曹颖瑛;李燕;谭光国;朱臻宇;;白假丝酵母活性代谢物种类及分离技术的研究进展[J];微生物与感染;2011年02期
13 饶志明;张君胜;沈微;方慧英;诸葛健;;根癌农杆菌介导工业化产甘油假丝酵母的遗传转化[J];应用与环境生物学报;2007年06期
14 彭奕冰;季育华;张玥;倪语星;;白假丝酵母临床分离株基因分型与药敏分析[J];检验医学;2006年01期
15 韦月平;;快速分离鉴定白假丝酵母[J];吉林农业科技学院学报;2006年02期
16 韦月平;;白假丝酵母的形态及理化鉴定[J];辽东学院学报;2006年02期
17 王鹏,韦月平,宋宇;白假丝酵母的快速分离鉴定[J];沈阳师范大学学报(自然科学版);2005年03期
18 王志;人畜共患真菌病(中)[J];中国兽医杂志;1988年03期
19 王红梅;周与良;;假丝酵母同源性的研究[J];真菌学报;1989年04期
20 乐静珠;潘云英;;假丝酵母一新种——北京假丝酵母[J];真菌学报;1984年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 陈林林;辛嘉英;张颖鑫;张帅;;粗状假丝酵母产脂肪酶发酵条件的优化[A];2009食品科技(北京)论坛会议指南[C];2009年
2 沈江伟;戚佳梅;柳志强;;南极假丝酵母脂肪酶B的改造及其应用[A];第十一届中国酶工程学术研讨会论文摘要集[C];2017年
3 吴起;Manfred T Reetz;;南极假丝酵母脂肪酶B的活性位点突变研究[A];第九届中国酶工程学术研讨会论文摘要集[C];2013年
4 赵丹丹;陈晓阳;吴起;林贤福;;南极假丝酵母脂肪酶B突变株催化不对称Aldol反应[A];第九届中国酶工程学术研讨会论文摘要集[C];2013年
5 戴颖欣;李敏;;耐氟康唑白假丝酵母耐药相关基因表达研究[A];第六届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛论文汇编[C];2015年
6 张云峰;李广泉;贺丹;钱永清;王丽;;白假丝酵母Hsp60免疫活性的研究[A];首届中国临床微生物学大会(宁波会议)暨《医学参考报》微生物学与免疫学论坛论文汇编[C];2010年
7 王宇凡;;临床白假丝酵母两性霉素B耐药菌株代谢轮廓分析[A];第七届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛论文汇编[C];2016年
8 檀文礼;高静;黄志红;;溶胶-凝胶法固定南极假丝酵母脂肪酶B过程中糖类保护剂的影响[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(上)[C];2006年
9 何耀强;王炳武;谭天伟;;假丝酵母99-125脂肪酶发酵工艺的研究[A];第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2004年
10 谭天伟;邓利;王芳;王炳武;;脂肪酶的生产及在化学品合成中的应用[A];第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 高楠;褶皱假丝酵母脂肪酶热稳定性改造的设计与抗氧化酶的人工模拟[D];吉林大学;2011年
2 苏国栋;南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母细胞表面高效展示体系的构建与定向进化研究[D];华南理工大学;2010年
3 陈献忠;产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因的克隆、表达与功能鉴定[D];江南大学;2008年
4 温赛;亚罗解脂假丝酵母脂肪酶的高水平重组表达、分子体外进化研究及其在手性拆分中的应用[D];北京化工大学;2012年
5 王丽凤;免疫活性肽模拟物的合成、生物活性及稳定性研究[D];吉林大学;2005年
6 齐岩峰;人促红细胞生成素小肽模拟物研究[D];吉林大学;2006年
7 吕绍武;基于环糊精的谷胱甘肽过氧化物酶模拟物的研究[D];吉林大学;2007年
8 宋相伟;Exendin-4高活性短肽模拟物的设计与筛选[D];吉林大学;2008年
9 冯杰;埃切假丝酵母产香机理及其对酱油风味的影响[D];江南大学;2012年
10 戴晓业;有机朗肯循环工质热稳定性研究[D];清华大学;2017年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 梁展斌;产甘油假丝酵母己糖高效跨膜转运研究[D];江南大学;2018年
2 郝月绰;皱褶假丝酵母脂肪酶CRL1在毕赤酵母的高效表达及催化合成维生素E醋酸酯[D];华南理工大学;2018年
3 王璐;非水相体系中褶皱假丝酵母脂肪酶催化合成丁酸香叶酯的研究[D];江南大学;2018年
4 耿笑林;麦芽糖假丝酵母混合糖代谢与转化利用研究[D];河南农业大学;2012年
5 牛源;植物内生真菌来源的抗真菌活性物质研究[D];吉林大学;2017年
6 李艳丽;产甘油假丝酵母筛选标记基因和整合位点基因的克隆[D];江南大学;2005年
7 蒋宏;酿酒酵母和水生假丝酵母原生质体融合研究[D];四川大学;2006年
8 宋保平;产甘油假丝酵母生理生化特性、倍性及不同碳源发酵代谢的研究[D];江南大学;2012年
9 张君胜;根癌农杆菌介导产甘油假丝酵母转化研究[D];江南大学;2006年
10 谷微微;假丝酵母发酵生产赤藓糖醇工艺优化研究[D];吉林农业大学;2007年
中国重要报纸全文数据库 前6条
1 中国农业科学院 王海燕 李富伟 高秀华;脂肪酶的研究进展及其在饲料中的应用[N];中国畜牧兽医报;2009年
2 记者 杨晓东 通讯员 张培军 李彦涛;全球首条煤制脂肪酶生产线投产[N];中国煤炭报;2014年
3 柯继;江南大学研制成功焙烤专用脂肪酶[N];中国食品报;2010年
4 梁庆华 余春槐;脂肪酶:安全多效催生焙烤业新工艺[N];中国食品报;2011年
5 ;脂肪酶[N];中国畜牧兽医报;2008年
6 钟璇;脂肪酶在烘焙产品中的作用及应用[N];中国食品报;2014年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978