重组人Aβ_（1-42）的制备及促进细胞凋亡作用的实验研究
【摘要】：科学研究表明,阿尔兹海默病(Alzheimer's disease, AD)的主要病理特征是细胞外老年斑的形成和细胞内神经纤维缠结的集聚,而老年斑的主要组成成分β-淀粉样蛋白42 (P-amyloid peptide, Aβ1-42)具神经元毒性,是AD的主要致病原因。神经干细胞(Neural Stem Cells, NSCs)是一类能自我复制,具有多向分化潜能细胞。神经干细胞的体外分离、体外培养、诱导分化到移植治疗,为神经系统损伤、神经退行性病变的治疗提供了有效的途径。鉴于此,本研究围绕Aβ1-42对细胞(人神经干细胞和人神经胶质瘤U251细胞)研究进行了如下工作。
利用基因重组技术构建了毕赤酵母真核表达载体pPICZaC-hAβ1-42电转化毕赤酵母X-33,筛选出能够稳定高效分泌表达重组人Aβ1-42 (rhAβ1-42)的工程菌。重组蛋白经SDS-PAGE、Western Blotting、ELISA分析,证明表达的rhAβ1-42具有生物学活性。对rhAβ1-42进行5L摇瓶水平发酵,并对其发酵条件进行优化,rhAβ1-42表达量达到210mg·L-1。建立了一种分离纯化rhAβ1-42的方法。
我们对人神经干细胞进行体外分离、诱导分化、体外传代培养,同时对原代获得的神经干细胞进行鉴定,观察rhAβ1-42对神经干细胞生长活力的影响。利用光镜、MTT、免疫荧光、透射电镜、DNA-ladder、流式细胞术等方法和技术,分析了rhAβ1-42对神经干细胞的生长曲线、细胞形态、超微结构和凋亡作用的影响。结果表明rhAβ1-42能够诱导神经干细胞凋亡,对其生长具有明显的抑制作用,其抑制作用可能是通过促进神经干细胞凋亡实现的。
利用光镜、MTT、免疫荧光、Western Blotting、流式细胞术等方法和技术,分析了rhAβ1-42对人神经胶质瘤细胞U251生长曲线、细胞形态和凋亡的影响。结果表明rhAβ1-42能诱导神经胶质瘤细胞U251的凋亡,对其生长具有明显的抑制作用。
本研究创新之处：1)对rhAβ1-42进行毕赤酵母工程菌的摇瓶水平发酵,优化表达条件,建立一种适合于小规模纯化rhAβ1-42的方法,纯度为93.8%。2)全面、系统地研究了rhAβ1-42对人神经干细胞和U251细胞的作用,证实rhAβ1-42能够抑制神经细胞增殖、诱导神经干细胞的分化和凋亡。国内外未见相关报道。
【关键词】：Aβ_(1-42) 神经干细胞 神经胶质瘤细胞 毕赤酵母 发酵 【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R749.16
【目录】：
- 内容提要4-5
- 中文摘要5-10
- Abstract10-21
- 第1章 文献回顾21-43
- 第1节 Aβ蛋白概述21-32
- 1.1 Aβ蛋白的来源和分类21-23
- 1.2 Aβ蛋白的分子结构23-24
- 1.3 Aβ蛋白与阿尔兹海默病24-31
- 1.4 Aβ蛋白的制备31-32
- 第2节 神经干细胞的研究进展32-43
- 2.1 神经干细胞的概念32-33
- 2.2 神经干细胞的来源与特性33-35
- 2.3 体外培养神经干细胞的应用35-40
- 2.4 转基因神经干细胞在脑及脊髓损伤中的作用40-41
- 2.5 神经干细胞研究的前景及展望41-43
- 第2章 rhAβ_(1-42)在毕赤酵母中的高效分泌表达及纯化工艺43-69
- 2.1 材料与方法43-58
- 2.1.1 器材及设备43-45
- 2.1.2 主要试剂及配制45
- 2.1.3 溶液配制45-47
- 2.1.4 质粒与菌株47
- 2.1.5 毕赤酵母的转化47-49
- 2.1.6 阳性菌株的筛选49-50
- 2.1.7 表达产物rhAβ_(1-42)分析50-52
- 2.1.8 确定毕赤酵母表达rhAβ_(1-42)的最佳pH值52-53
- 2.1.9 rhAβ_(1-42)的摇瓶水平发酵表达53
- 2.1.10 rhAβ_(1-42)的小量纯化53-56
- 2.1.11 rhAβ_(1-42)的分析鉴定56-58
- 2.2 结果58-62
- 2.2.1 PCR方法筛选rhAβ_(1-42)转化阳性菌株58-59
- 2.2.2 Tricine-SDS-PAGE筛选rhAβ_(1-42)表达的高峰时间59
- 2.2.3 SDS-PAGE筛选高表达rhAβ_(1-42)的工程菌59-60
- 2.2.4 毕赤酵母表达rhAβ_(1-42)最佳pH值的确定60-62
- 2.3 rhAβ_(1-42)的小量纯化62-64
- 2.3.1 硫酸铵分级沉淀62
- 2.3.2 透析62
- 2.3.3 AKTA Explorer中压层析系统纯化62
- 2.3.4 Tricine-SDS-PAGE和Western blotting分析纯化rhAβ_(1-42)62-64
- 2.4 讨论64-69
- 第3章 rhAβ_(1-42)促进人神经干细胞凋亡作用的研究69-97
- 3.1 材料和方法69-77
- 3.1.1 器材及设备69-70
- 3.1.2 主要试剂及配制70
- 3.1.3 溶液配制70-71
- 3.1.4 Aβ_(1-42)寡聚体的制备71
- 3.1.5 神经干细胞和皮肤成纤维细胞的原代培养71-72
- 3.1.6 神经干细胞的鉴定72-73
- 3.1.7 形态学特征观察73
- 3.1.8 rhAβ_(1-42)对神经干细胞生长作用的检测73-75
- 3.1.9 流式细胞术检测rhAβ_(1-42)对神经干细胞凋亡率的影响75
- 3.1.10 rhAβ_(1-42)致人神经干细胞的神经发生效应75-76
- 3.1.11 DNA琼脂糖凝胶电泳76
- 3.1.12 超微结构分析76-77
- 3.2 结果77-91
- 3.2.1 神经干细胞和皮肤成纤维细胞的分离、培养和形态学观察77-79
- 3.2.2 神经干细胞的鉴定79-80
- 3.2.3 rhAβ_(1-42)对神经干细胞形态的影响80-81
- 3.2.4 rhAβ_(1-42)对神经干细胞生长作用的检测81-86
- 3.2.5 rhAβ_(1-42)对人皮肤成纤维细胞的作用86-87
- 3.2.6 rhAβ_(1-42)对神经干细胞凋亡率的影响87-89
- 3.2.7 DNA琼脂糖凝胶电泳89
- 3.2.8 透射电子显微镜下观察对神经干细胞超微结构的影响89-90
- 3.2.9 神经发生效应90-91
- 3.3 讨论91-97
- 第4章 rhAβ_(1-42)促进人神经胶质瘤U251细胞凋亡作用的研究97-111
- 4.1 材料与方法97-102
- 4.1.1 器材及设备97-98
- 4.1.2 主要试剂及配制98
- 4.1.3 溶液配制98-99
- 4.1.4 细胞培养99
- 4.1.5 细胞体外增殖能力测定99-100
- 4.1.6 细胞形态学观察100
- 4.1.7 AO/EB观察细胞形态学改变100-101
- 4.1.8 流式细胞术检测rhAβ_(1-42)对U251细胞的凋亡作用101
- 4.1.9 Western blotting101
- 4.1.10 统计学方法101-102
- 4.2 结果102-107
- 4.2.1 rhAβ_(1-42)对U251细胞增殖能力的影响102-103
- 4.2.2 倒置相差显微镜下观察细胞形态变化103
- 4.2.3 AO/EB双染法观察细胞凋亡形态学改变103-105
- 4.2.4 流式细胞术分析rhAβ_(1-42)对U251细胞的凋亡影响105-106
- 4.2.5 Western blotting检测不同浓度rhAβ_(1-42)对U251细胞凋亡蛋白bax,bcl-2的表达情况106-107
- 4.3 讨论107-111
- 研究总结111-113
- 参考文献113-125
- 攻读博士期间所取得科研成果125-127
- 致谢127
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