重组导向毒素DLM表达、抗肿瘤活性及作用机制的初步研究

【摘要】：导向毒素具有特异性结合、杀伤肿瘤细胞的特性。但是,目前研究的许多导向毒素在实际应用过程中却表现出抗肿瘤疗效差,非特异性毒性强的问题。为开发高特异性低毒的导向毒素,本研究以蛇毒去整合素作为导向毒素的载体,以对细胞具有杀伤作用的蜂毒肽作为导向毒素的弹头,通过维持蛋白质结构功能的连接肽和释放毒素分子的uPA切割序列作为接头,设计出重组导向毒素DLM(蛇毒去整合素-接头-蜂毒肽,Disintegrin-linker-melittin, DLM)。 首先采用大肠杆菌原核表达系统对其进行表达,得到了少量的DLM蛋白。为了进一步提高DLM的产量,我们构建了毕赤酵母真核表达载体,并筛选出能够稳定、高效分泌表达DLM蛋白的毕赤酵母工程菌。 通过SDS-PAGE、Western Blot、质谱测定相对分子量等手段,证明了DLM通过毕赤酵母表达系统成功分泌表达。利100 L用发酵罐进行DLM中试规模发酵,并摸索其纯化工艺,最终DLM的产量达到198.4 mg/L。 通过体外酶解实验,证实了重组蛋白DLM的uPA接头的可切割性。进行了DLM溶血实验及对人胚肾细胞抑制作用实验。结果显示DLM几乎无溶血活性,对人胚肾细胞无明显的抑制作用。利用光镜、荧光显微镜、DNA电泳、流式细胞仪技术,观察了DLM对乳腺癌细胞MCF-7的形态、超微结构、生长、基因组DNA等指标的影响,初步探讨出其作用机制。 本研究的创新之处在于：①首次以蛇毒去整合素作为导向载体,针对肿瘤细胞表面特异性受体αvβ3设计高特异性的导向毒素；②首次以uPA切割序列作为导向毒素的接头,通过肿瘤细胞表面uPA对接头的切割作用,释放毒素分子；③通过uPA对接头的切割作用,将弹头分子蜂毒肽释放于肿瘤细胞表面,通过裂解细胞膜发挥其对细胞的杀伤作用。