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《吉林大学》 2011年
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重组鲎素的规模化制备及其体内外生物学效应与作用机制

冯新  
【摘要】:2011年4月7日为世界卫生日,世界卫生组织发出了“抗生素耐药性:今天不采取行动,明天就无药可用(Combat Drug Resistance: No Action Today, No Cure Tomorrow)”的呼吁。抗生素耐药性产生的主要问题在于:临床抗生素的不合理使用及抗生素作为饲料添加剂的广泛使用甚至是滥用。因此,研究和开发新型、安全的无药物残留、无耐药性的抗菌制剂是一项重要而迫切的科学问题。 抗菌肽自1972年被发现以来,以全新的抗菌机理和卓越的效果一直被认为是开发抗菌药物的新方向。近年来的研究表明,抗菌肽不仅可直接杀灭侵入体内的病原微生物,还在宿主固有免疫应答的不同阶段表现出多种有益的作用。根据目前国内外研究进展和发展趋势,抗菌肽有望成为今后饲料抗生素的替代品。抗菌肽在畜禽养殖业上的研究与应用,将是实现健康养殖、消除抗生素残留的重要措施,使养殖业尽早告别多年来饲料中添加抗生素的尴尬局面,开创绿色养殖的新理念。然而,抗菌肽的抗微生物作用机理、抗菌肽与动物机体相互作用关系的研究,是突破抗菌肽作为抗微生物制剂及饲料添加剂规模化应用瓶颈的关键环节、是抗菌肽能否被批准走入市场的理论依据、是完善和增强抗菌肽制剂公众认识和信心的重要保障。 本研究成功构建了鲎素(Tachyplesin I)的组成型酵母表达菌株,以葡萄糖为诱导剂可分泌表达高活性的重组鲎素。用响应面法对诱导表达条件进行了优化,以优化的表达条件为基础,在7.5 L发酵罐中放大培养表达出高活性的重组鲎素。用高效液相色谱法对发酵产物进行定量检测结果表明,发酵产物上清中重组鲎素的平均表达量可达40 mg/L。用质谱法对发酵产物进行定性检测结果显示,分子量为2263.79 d与理论测算完全相同。用平板打孔法和微量稀释法测定了重组鲎素对14个种属61株细菌的抑菌活性,结果显示重组鲎素具有广谱的抑菌活性;对革兰氏阴性的大肠杆菌、沙门菌、空肠弯曲菌和变形杆菌和革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、链球菌和屎肠球菌抑菌效果较强,抑菌圈直径均超过20 mm;尤其对革兰氏阳性细菌的抑菌效果明显,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度仅为0.63μg/mL、对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为0.63μg/mL;对氟喹诺酮耐药的金黄色葡萄球菌的抑菌活性与非耐药菌株抑菌效果相同,表明鲎素的抑菌活性不受细菌的耐药性影响。鲎素体内抑菌效果显著,对金黄色葡萄球菌表皮感染有明显的治疗效果,达到与抗生素相同的治疗效果。 使用鲎素标准品免疫BALB/c小鼠,获得了五株单克隆抗体,四株单抗2D8、3B8、5H2和8F5属于IgG1亚型,6B12属于IgG2a亚型,其中8F5特异性最强,Western-blot检测结果显示单抗与重组鲎素反应性良好。 鲎素抗病毒实验结果表明,对新城疫病毒F48E9中国标准强毒株作用效果明显,在0.1 MOI的新城疫病毒与Vero细胞体系中,蚀斑减少实验结果显示10μg/mL的鲎素可消除65%的蚀斑,荧光定量RT-PCR检测结果显示,体系中F48E9株病毒的病毒载量减少了57%。通过DiBCA荧光探针标记Vero细胞后,用流式细胞仪监测细胞膜电位变化,结果表明,F48E9株病毒感染Vero细胞导致细胞膜发生超级化,鲎素对F48E9吸附过程中膜电位的超级化状态有明显干预作用。使用NBD-C6-HPC探针标记Vero细胞,激光共聚焦进行荧光淬灭比较鲎素对F48E9株病毒吸附Vero细胞过程中细胞膜流动性的影响结果显示,鲎素具有明显促进F48E9感染后细胞膜流动性恢复的作用,显示出鲎素对靶细胞的保护作用。 使用重组鲎素冻干粉作为饲料添加剂进行麻鸡饲喂效果观察结果显示,200克/吨的重组鲎素添加量对麻鸡增重和胸腺和法氏囊指数均显著高于空白对照组,与抗生素添加组效果差异不显著。200克/吨的重组鲎素添加量对麻鸡肠绒毛影响结果显示,与空白对照组相比,肠绒毛排列更加紧密,绒毛分支增多,与抗生素添加组效果差异不显著。免疫组织化学染色结果表明,重组鲎素在肠粘膜上皮表面、肠腺周围,特别是肠绒毛表面均有分布,说明重组鲎素可以增强麻鸡的消化功能促进麻鸡的生长发育。 以肠道宏基因组学为研究手段,建立了有效区分肠道菌群16s rRNA基因片段的变性高效液相色谱法(DHPLC),分析结果显示抗菌肽添加后肠道菌群的种类更加集中,中剂量组与空白对照组肠道菌群组成存在差异,空白对照组菌群组成更为复杂,同时有多种细菌共生,而中剂量组的菌群组成较简单。说明重组鲎素饲料添加剂调节了麻鸡肠道的菌群平衡,而提高了麻鸡的生长优势。 本研究通过基因工程方法获得了可高效表达和可规模化发酵生产的重组鲎素,经过对发酵条件的优化,发酵上清中重组鲎素的表达量可达40mg/L。以14个种属的61株细菌为实验菌株,较为全面的测定了重组鲎素的抑菌谱,评价了重组鲎素对小鼠金黄色葡萄球菌感染模型的治疗效果。重组鲎素抗新城疫病毒效果明显,可有效抑制病毒吸附靶细胞,抑制病毒感染的靶细胞膜超极化,促进病毒感染的细胞膜流动性的恢复,显示出重组鲎素对靶细胞膜的保护作用。适当的浓度的重组鲎素可有效促进麻鸡生产性能和免疫功能,可以增强麻鸡的消化功能促进麻鸡的生长发育,其作用与抗生素添加剂效果相同。重组鲎素对麻鸡消化道菌群有显著的影响,重组鲎素添加后肠道菌群的种类更加集中,空白对照组菌群组成更为复杂,同时有多种细菌共生,而中剂量组的菌群组成较简单。说明重组鲎素饲料添加剂调节了麻鸡肠道菌群平衡,而提高动物生产性能。最终为鲎素作为抗微生物制剂和饲料添加剂的应用提供了实验和理论依据。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S859.79

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