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《吉林大学》 2011年
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旋毛虫有效抗原成分对炎症性肠病免疫干预研究

孙树民  
【摘要】:炎症性肠病(IBD)是一种病因不明的自身免疫性疾病,包括溃疡性肠炎(UC)和克罗恩病(CD)是肠道慢性、复发性病症。自身免疫失衡是IBD发病的直接诱因。环境和遗传因素在IBD的免疫中起重要作用。当环境因素作用于有遗传易感性的个体时,就可能引发机体免疫系统功能失调而发病,IBD在卫生条件较好的发达国家发病率较高,而在卫生不好、条件差的国家发病率反而较低。单纯用环境和遗传因素很难解释这种差异的,因为欠发达地区移民到发达地区的人群IBD发病率较高。这些结果说明,环境因素对IBD的发生是重要的。即而产生了IBD“卫生假说”的理论,即IBD的发生是在缺少对肠道粘膜刺激较少的社会。线虫感染较多国家CD和UC的发病率低,说明肠道寄生虫的感染有效的解释了这个问题。前期工作中以旋毛虫(T.spiralis)作为干预小鼠肠炎模型产生较好的治疗作用。尽管寄生虫对IBD的治疗有益,寄生虫感染所引发的生物安全性问题一直受人关注。活体寄生虫持续感染人体不易被排出体外,可能会影响胃肠的功能,并导致病人心理上难以接受这种治疗。因此,在维持寄生虫生命周期的条件下,利用寄生虫进行大规模治疗并不可行。寄生虫提取物可以与活虫具有相同的治疗效果,不但可以避免感染活虫的隐患,还能使病人更容易接受。旋毛虫有效抗原成分可避免活虫治疗IBD的不利因素,同时保留了旋毛虫对IBD的免疫调控作用,理论上是符合临床治疗要求的生物制剂。 本研究选择已鉴定好的旋毛虫有效抗原成分,即ZH68旋毛虫成虫抗原基因(丝氨酸蛋白酶);WM5旋毛虫肌幼虫抗原基因(丝氨酸蛋白酶抑制剂);WN10旋毛虫新生幼虫抗原基因(半胱氨酸蛋白酶抑制剂);T668旋毛虫新生幼虫抗原基因(丝氨酸蛋白酶),构建可溶性蛋白表达载体,并对抗原基因表达产物进行纯化,目的是获得纯度较高的基因表达产物。其方法是利用镍琼脂糖凝胶FF色谱分离带有His标签的重组蛋白pET-22b-T668、pET-22b-ZH68、pET-22b-WM5和pET-22b-WN10。将纯化浓缩的四种可溶性蛋白在无菌条件下经腹腔注射BALB/c鼠,以生理盐注射水作为对照。三次免疫后用TNBS诱导动物模型,观察诱导CD模型指标的变化情况,包括小鼠的平均体重、生存率、DAI评分、结肠宏观评分和微观损伤评分,检测炎症指标MPO、SOD活性,探讨四种可溶性蛋白对动物模型的治疗效应。实时定量RT-PCR检测各组模型鼠肠粘膜、肠系膜淋巴结及脾脏中IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-4、IL-17和TGF-βmRNA的表达含量,用ELISA法检测各组小鼠结肠(LPMC)和脾脏中IFN-γ、IL-12、TGF-β、IL-4、IL-10和IL-17的分泌水平,从而动态研究肠道粘膜免疫和细胞免疫作用关系;并通过流式细胞仪检测(FCM)各组脾细胞内CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞数量变化。从细胞水平阐述Treg对机体免疫方面的作用,客观论述蛋白对IBD模型鼠的免疫作用机制。 旋毛虫抗原基因WM5、WN10、Zh68和T668克隆入原核表达载体pET-22b中进行表达。经鉴定四种抗原基因未发生突变,具有完整的开放阅读框,基因全长分别是1315bp、1352bp、1372bp和1609bp,切除信号肽后表达成熟蛋白分子量理论为37.7 kDa、46.9 kDa、47 kDa、49 kDa,表达的融合蛋白的大小与理论相符。表达产物通过镍琼脂糖凝胶柱进行亲和层析分离纯化,SDS-PAGE和Western-Blot检测蛋白质具有良好的免疫原性和反应原性。 旋毛虫有效抗原成分对肠炎模型干预效应结果显示,Zh68和T668蛋白免疫后TNBS诱导鼠模型组平均体重和生存率显著高于盐水注射后造模组,(p0.05),各项临床症状均轻于盐水注射后造模组,DAI评分明显降低(p0.05)。预先免疫Zh68和T668蛋白小鼠于TNBS诱导造模后3d及7d与生理盐水模型组相比在结肠宏观损伤和微观损伤评价上都有所改善(p0.05),粘膜损伤轻微,结肠壁增厚较少、粘连范围较窄,溃疡面浅或临近正常组织,炎性细胞浸润范围较小、减弱,水肿范围较小,MPO值降低,差异显著(p0.05)。SOD评价值显示,盐水注射造模组3d后明显高于蛋白免疫试验组(p0.05),7d后差异不显著(p﹥0.05)。WM5和WN10蛋白免疫造模组与盐水注射未造模组之间没有明显的差异。实时定量RT-PCR结果显示:ZH68和T668蛋白免疫后造模组3d结肠中IFN-γ、IL-12和IL-17 mRNA的表达量显著低于盐水注射造模组(p0.05),而IL-4、IL-10和TGF-βmRNA的表达显著升高(p0.05)。各组蛋白免疫后造模组肠系膜淋巴结中IFN-γ、IL-12和TGF-βmRNA的表达量对盐水注射后造模组没有显著变化,ZH68和T668蛋白后造模组IL-17和IL-10 mRNA的表达量显著下降(p0.05),IL-4 mRNA的表达量显著升高(p0.05)。ZH68和T668蛋白免疫后造模组小鼠在造模脾脏中IL-17、IL-10 mRNA的表达量对模型组的表达显著下降(p0.05),其它细胞因子表达没有显著性差异(p0.05)。ELISA结果显示:ZH68和T668蛋白免疫造模组3d及7d后的IL-10和TGF-β小鼠结肠组织LPMC产生水平显著高于盐水注射造模组(p0.05),而IFN-γ、IL-17和3d后的IL-12 LPMC产生水平显著低于盐水注射造模组(p0.05),7d后的IL-12水平和3d后的IL-4 LPMC产生水平没有变化(p0.05),7d后的IL-4 LPMC产生水平显著高于盐水注射造模组(p0.05)。ZH68和T668蛋白免疫造模组3d及7d后小鼠脾脏淋巴细胞的IL-4、IL-10和TGF-β表达显著高于盐水注射后造模组(p0.05),IL-17产生水平显著低于盐水注射造模组(p0.05),3d后脾脏淋巴细胞产生IFN-γ的水平及第7dIL-12的产生水平与模型组相比未见明显差异(p0.05),7d后脾脏淋巴细胞产生IFN-γ的水平及第3d IL-12的水平显著低于盐水注射造模组(p0.05)。实时定量RT-PCR和ELISA结果显示:WM5和WN10蛋白免疫后造模组变化不显著(p0.05),各蛋白免疫造模组与盐水注射未造模组相比上述显著差异基础上的细胞因子表达呈现相反的结果。流式细胞检测显示:ZH68和T668蛋白免疫后造模组7d脾淋巴细胞表达CD4+ CD2+ Foxp3+ Treg细胞数占CD4+T淋巴细胞的百分率明显低于盐水注射后造模组(p0.05),WM5和WN10蛋白免疫后造模组脾淋巴细胞表CD4+ CD2+ Foxp3+ Treg细胞数占CD4+T淋巴细胞的百分率与盐水注射后造模组相比没有显著变化(p0.05);而3d疾病活动期各组没有明显差异(p0.05)。 旋毛虫有效抗原成分免疫后造模小鼠均表现出对TNBS诱导结肠炎模型具有较好的治疗效应,其可能的机制是:有效抗原成分恢复IBD模型鼠Th1/Th2正常的平衡;抑制了机体的免疫反应和免疫细胞和细胞因子发挥超强的免疫调剂作用,从而使机体免疫失衡恢复到正常水平。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R392

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 孙树民;王学林;郭恒;刘明远;;旋毛虫抗原基因T668重组蛋白对鼠结肠炎的保护效应[J];中国兽医学报;2014年03期
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前6条
1 李莲瑞;付宝权;卢强;韩文瑜;刘明远;;旋毛虫丝氨酸蛋白酶基因的克隆与分析[J];中国兽医科学;2008年03期
2 赵颖;杨世忠;邹洪斌;王学林;王岚;孙艳;刘明远;;旋毛虫对三硝基苯磺酸诱导的实验性小鼠肠炎模型的干预研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2007年06期
3 牛廷献,潘菲菲,刘明远,卢强,付宝权,Pascal Boireau;以重组蛋白为抗原的ELISA法检测旋毛虫抗体[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2005年03期
4 原丽红,付宝权,刘明远,张亚兰,高飞,吴秀萍,李莲瑞,林本夫,卢强,陈启军,P.Boireau;旋毛虫编码新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白对小鼠的免疫保护性研究[J];中国人兽共患病杂志;2005年03期
5 张亚兰,付宝权,刘明远,原丽红,吴秀萍,李莲瑞,卢强,陈启军,P.Boireau;旋毛虫3日龄成虫cDNA文库的免疫筛选[J];中国兽医学报;2004年04期
6 王学林;王心蕊;吴秀萍;孙磊;于申业;李文辉;刘明远;;旋毛虫T668基因转录及表达的时空特性鉴定[J];中国兽医学报;2008年11期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 吴秀萍;刘相叶;王学林;张小玲;王子见;唐斌;陈根元;杨勇;刘明远;;旋毛虫肠道1期幼虫抗原性基因的筛选与分析[J];动物医学进展;2009年08期
2 于建立;白雪;刘国兴;吴秀萍;王学林;刘明远;;旋毛虫成虫丝氨酸蛋白酶对S774A.1巨噬细胞的毒性作用[J];动物医学进展;2011年10期
3 吴秀萍;赫荣华;邹洪斌;杨志东;P.Boireau;刘明远;;旋毛虫肌幼虫强反应原性抗原基因的筛选及生物学特性分析[J];吉林农业大学学报;2008年02期
4 杜婧;刘攀;唐斌;高鹤;刘明远;;旋毛虫T626-55基因减毒沙门氏菌疫苗的构建及其在小鼠体内表达[J];吉林农业大学学报;2011年06期
5 朱江巍;;旋毛形线虫感染鼠血清P49抗体消长规律的研究[J];现代畜牧兽医;2013年06期
6 毛立群;杨静;牛秀珑;李覃;肖颖;叶路;孙奕;;旋毛虫新生幼虫抗原免疫小鼠免疫功能的动态观察[J];武警医学院学报;2009年11期
7 刘揆亮;吕愈敏;顾芳;;益生菌在炎症性肠病中的应用[J];世界华人消化杂志;2010年36期
8 高源;张振;王宝香;鲍连生;彭罕鸣;;嗜酸乳杆菌对感染人轮状病毒乳鼠肠黏膜的保护作用[J];世界华人消化杂志;2011年28期
9 李莲瑞;付宝权;卢强;韩文瑜;刘明远;;旋毛虫丝氨酸蛋白酶基因的克隆与分析[J];中国兽医科学;2008年03期
10 于申业;吴秀萍;王学林;于录;王心蕊;杨勇;冯晓静;刘明远;;旋毛虫p46000抗原基因的转录及表达特性鉴定[J];中国兽医科学;2009年05期
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 赵颖;杨世忠;朴云峰;高普均;王岚;刘明远;;旋毛虫对三硝基苯磺酸诱导肠炎小鼠Th1/Th2类细胞因子基因表达的影响[J];吉林大学学报(医学版);2007年01期
2 牛廷献,刘明远,卢强,付宝权,Pascal Boireau;旋毛虫新生幼虫T668重组抗原对小鼠的保护性免疫[J];免疫学杂志;2005年01期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 申丽洁,黎世涛,王秀珍,朱声华,罗仲金;旋毛虫三种抗原作为免疫诊断抗原的比较研究[J];地方病通报;1999年02期
2 崔晶,王中全,王会智,张荣光,赵国强;旋毛虫河南株TspE1基因克隆及多态性分析[J];郑州大学学报(医学版);2002年03期
3 丁利,诸欣平,杨静,王少华,周蕾;旋毛虫Ts87重组蛋白诱发小鼠保护性免疫的研究[J];寄生虫与医学昆虫学报;2003年04期
4 刘明远,付宝权,卢强,吴秀萍,姚春雨,宇丽,窦兰清,P.Boireau;旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建[J];中国兽医科技;2001年03期
5 付宝权,刘明远,王锋,吴秀萍,卢强,黎诚耀,窦兰清,P.Boireau;旋毛虫5日龄成虫期特异性基因片段的克隆及鉴定[J];中国兽医科技;2001年11期
6 孟学平,付宝权,卢强,吴秀萍,王锋,牛廷献,黎诚耀,刘明远,P.Boireau;旋毛虫FYVE锌指结构蛋白基因的克隆及表达[J];中国兽医科技;2001年12期
7 余兴龙,涂长春,李作生,马正海,李红卫,吴健敏,吕宗吉,殷震;以重组mE2蛋白为抗原建立检测猪瘟病毒抗体间接ELISA方法的研究[J];中国预防兽医学报;1999年03期
8 杨雅平,诸欣平,杨静,周蕾,黄松;旋毛虫成虫cDNA文库免疫筛选及序列分析[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2002年05期
9 崔晶,王中全,王会智,赵国强,张红卫;旋毛虫成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1的克隆与表达[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2002年05期
10 温艳,甘绍伯,劳为德,高虹,张传生,刘思国;旋毛虫p49基因的克隆、序列分析及表达[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2002年06期
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1 吴勤学,李新宇,尹跃平,魏万惠,叶干运;抗麻风杆菌及其抗原成分单克隆抗体的研制[J];中国医学科学院学报;1995年02期
2 石宗舫,刘长明,隋广超,卢景良;羊种布鲁氏菌抗原成分分析及其保护性鉴定[J];中国地方病学杂志;1991年04期
3 钟慧平 ,杨晓慧;中草药的 M、N 与 T 抗原成分检测[J];中南大学学报(医学版);1983年04期
4 赖玉琼,杨希立,李鸣,胡晖,杨光;幽门螺杆菌及其不同抗原成分对冠心病患者脂代谢的影响[J];中国综合临床;2005年06期
5 赵战云,颜炳丽,王建英,牟美玲;乙型肝炎病毒抗原成分在其相关性肾炎中的分布[J];中华流行病学杂志;1997年02期
6 童竞亚,罗组才,吴浔音;粗制霍乱肠毒素和大肠杆菌不耐热肠毒素抗原成分研究[J];赣南医学院学报;1983年00期
7 孙茂倬,杨光宏,刘景福,巩翠华;山东省11株肾综合征出血热病毒抗原分析及毒力测定[J];疾病监测;2000年03期
8 孙茂倬,杨光宏;地方株肾综合征出血热病毒生物学特性研究[J];中国人兽共患病杂志;2002年04期
9 王俊霞,孙树汉,郭庆;猪囊尾蚴抗原分析[J];医学动物防制;1996年03期
10 曹祖华,陈仁;肿瘤患者血清中胎盘蛋白的检测[J];癌症;1986年02期
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1 夏潮涌;夏志坚;;图像分析仪测定组织细胞形态与化学成份含量中若干值得注意的问题[A];中国体视学学会’99学术报告会论文集[C];1999年
2 姜笃银;陈璧;马福成;;猪皮肤抗原性的免疫组织化学研究[A];中华医学会第六届全国烧伤外科学术会议论文汇编[C];2001年
3 才学鹏;;猪囊虫免疫预防研究进展[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集[C];2005年
4 苏胜兵;张晓轩;徐凤宇;;噬菌体在细菌性疾病诊断和治疗中的应用[A];第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛论文集(上册)[C];2010年
5 李光蓉;卢润生;唐小佳;杨奇;蒋绍双;;急性结核感染动物的心血管组织的光镜和电镜观察[A];中国动物学会全国显微与亚显微形态科学分会第十次形态科学与显微注射技术学术研讨会论文摘要集[C];2000年
6 韩金萍;张莉;;青海西宁地区348例接触性皮炎、湿疹斑贴试验结果分析[A];第一届全国变态反应学术研讨会论文汇编[C];2001年
7 田纯见;曹永长;毕英佐;;口蹄疫病毒3C基因的克隆和噬菌体展示[A];猪的重要传染病防治研究新成果——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第五届理事会第二次全体会议暨防检疫专业委员会第7次学术交流会论文集[C];2002年
8 王雪峰;王帅;林跃智;姜成刚;吕晓玲;赵利平;王凤龙;周建华;;马传染性贫血弱毒疫苗株致弱过程中不同代次毒株的膜表面蛋白gp90进化分析[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集[C];2010年
9 程萍;;自身免疫病的检验[A];贵州省医学会风湿病学分会第四届学术年会专题论文汇编[C];2010年
10 邓柏林;韦海涛;张西臣;;隐孢子虫免疫防治研究进展[A];微生物实用技术生态环境应用学术研讨会论文集[C];2008年
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1 ;我国专有的乙肝疫苗的张江投产[N];中国高新技术产业导报;2002年
2 季楠;“颜面皮炎”乃美貌之敌[N];中国医药报;2004年
3 胥金章 黄显斌;激素治非典为啥有效[N];科技日报;2003年
4 季玉光;孩子有病慢接种[N];大众卫生报;2004年
5 宜仁;避开诱因哮喘患者照样“性福”生活[N];大众卫生报;2005年
6 欧强 李涛;抗病毒主力军———α—干扰素[N];大众卫生报;2003年
7 河北远征药业股份有限公司 杨少英;断奶仔猪腹泻的一些防治措施[N];中国畜牧报;2004年
8 倪合一;为啥会反复感冒[N];辽宁日报;2000年
9 胥金章、唐显斌;中国军队专家治疗非典研究获得突破[N];人民日报海外版;2003年
10 本报记者 鲁海燕 通讯员 胥金章 黄显斌;专家解读激素治疗之谜[N];华夏时报;2003年
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1 孙树民;旋毛虫有效抗原成分对炎症性肠病免疫干预研究[D];吉林大学;2011年
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1 姜金珠;应用基质金属蛋白酶脱除猪脱细胞真皮基质抗原成分的研究[D];山东大学;2011年
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5 赵红;弓形虫SAG1-ROP2复合基因疫苗与免疫佐剂大肠埃希菌肠毒素B亚基对小鼠的免疫保护性研究[D];山东大学;2010年
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8 宋秋荷;两种单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立[D];第三军医大学;2004年
9 钱雯;Y群流行性脑脊髓膜炎球菌培养工艺的摸索[D];昆明理工大学;2012年
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