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《吉林大学》 2012年
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肌萎缩侧索硬化信号传导通路蛋白表达谱筛选和分析

殷飞  
【摘要】:目的:肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)是一个致命的神经退行性疾病,表现为进展性的肌肉无力、萎缩。迄今还不知道确切的ALS致病原因和发病机制,从发病起50%病人的平均存活时间为2.5年,5年生存率平均仅为25%。对于ALS患者,缺乏早期诊断方法和有效的治疗手段是目前面临的主要问题,因此需要找到有效的分子标志物。我们实验的目的是筛选出用于参与其分子生物学机制的蛋白,帮助ALS诊断和影响预后的蛋白质靶点,并找出这些蛋白质所参与的信号传导通路。 方法:应用蛋白通路芯片技术(Protein PathwayArray,PPA),134种磷酸化和非磷酸化抗体,检测36例ALS患者骨骼肌组织、17例脊肌萎缩症(Spinal MuscularAtrophy,SMA)患者骨骼肌组织和36例正常对照的骨骼肌组织蛋白质表达情况。发现在ALS骨骼肌组织和正常对照的骨骼肌组织中差异表达的蛋白,应用聚类分析鉴定差异蛋白,并应用Ingenuity PathwayAnalysis(IPA)分析软件和Exploratory GeneAssociation Networks(EGAN)软件研究差异表达的蛋白对ALS信号传导网络的影响。将以上差异表达的蛋白在36例ALS骨骼肌组织和17例SMA骨骼肌组织中的表达情况做了比较,进一步分析差异蛋白。对36例ALS患者进行了苏木精-伊红(HE)染色和还原型辅酶Ⅰ四唑氮还原酶(NADH-TR)染色,通过光镜观察病理情况,比较不同程度肌萎缩与蛋白表达的关系。研究ALS蛋白表达谱与患者的年龄、性别、ALS功能量表修订版(ALS-FRSr)评分和发病部位等临床特征之间的关系和ALS蛋白表达谱与诊断水平之间的关系。用36例ALS骨骼肌组织进行生存分析,找到影响生存的风险因素,应用Western-Blot技术进行验证。 结果:我们的研究发现,在正常对照的骨骼肌组织和ALS骨骼肌组织中共有17种蛋白存在差异表达,应用分层聚类分析这17个差异蛋白可将ALS骨骼肌组织和正常对照的骨骼肌组织分开为两类;IPA系统分析结果表明,这些蛋白与细胞生长和增殖,基因表达,细胞周期和自由基清除相关。EGAN软件结果显示蛋白与骨骼肌系统形态发生,肌肉组织、结构发育,骨骼肌系统发育,肌细胞增殖、分化,调控肌肉收缩,神经系统发生、发育,神经分化、迁移,神经元死亡、凋亡,对DNA损害、氧化应激应答有关。以上17个差异蛋白中有9个蛋白在ALS和SMA患者之间比较也有显著表达差异,可能与ALS的分子生物学机制有关。组织化学染色可见36个ALS患者有不同程度的肌萎缩存在,NADH-TR染色可见靶纤维和肌纤维群组化现象。在不同年龄、性别、ALS-FRSr评分、萎缩程度、起病部位的ALS患者中,存在蛋白差异表达;研究中找到5个蛋白在4个不同诊断程度的组别中有表达差异,可能做为帮助判断诊断的生物标志物,我们的结果还表明Akt和Factor XIII B的表达水平是影响ALS预后的独立风险因素,Akt和Factor XIIIB低表达的患者总体预后差,基于这两个蛋白计算得到的风险评分可以预测每一例患者的预后情况,应用Western-Blot技术进行验证蛋白表达情况和以上结果一致。 结论:本课题以ALS信号传导通路为研究重点,通过对ALS、SMA及正常对照的骨骼肌组织标本中的蛋白表达进行筛选和IPA分析,研究在ALS骨骼肌组织和正常对照的骨骼肌组织中的差异表达,研究蛋白信号传导通路在ALS的肌细胞和神经元发生、增殖、分化和凋亡的作用。发现ALS中存在广泛的信号传导蛋白表达的异常,其中9个蛋白可能与ALS的分子机制相关,5个蛋白可能被选作与临床病理诊断相关的分子标志,10个蛋白可能与临床特征相关,特别是Akt和Factor XIII B两个蛋白可以作为判断预后的有用的分子标志物,为评价患者预后建立一种行之有效的检测系统。这种高通量检测蛋白质的实验模式,为ALS在蛋白质水平的研究奠定了基础。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R744.8

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