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《吉林大学》 2012年
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两亲性高分子键合紫杉醇胶束对卵巢癌SKOV3细胞作用的实验研究

董丹  
【摘要】:研究背景: 卵巢癌是女性生殖系统肿瘤中死亡率最高的恶性疾病,严重影响着女性的生活质量和生命健康。因其起病隐匿、缺乏有效的早期筛查手段,临床确诊患者70%已是疾病晚期。上皮性卵巢癌占卵巢恶性肿瘤的85~90%,绝大多数的上皮性卵巢癌都是化疗敏感性癌,目前临床治疗的标准方案是行初次肿瘤细胞减灭术(optimal primarycytoreductive surgery,OPCS),术后辅以紫杉类和铂类药物联合应用的系统化疗。但是由于化疗药物本身或者药物溶媒显著的毒副作用,以及由于肿瘤细胞对化疗药物的耐受现象不断出现,化学治疗往往很难达到理想的效果。众多医药研究者一直在尝试获得疗效好、作用持久、毒副作用少、生物利用度高的化疗药物,目的是提高卵巢癌患者的生活质量,延长患者的生存时间。 紫杉醇(Paclitaxol,商品名Taxol,略作PTX)是用于治疗卵巢癌的一线化疗药物,但是由于其水溶性差,临床用市售紫杉醇注射液多以聚氧乙烯蓖麻油/无水乙醇(体积比1:1)混合液作为溶剂。无论是紫杉醇纯药本身还是溶剂都能引起严重过敏、溶血、神经毒性等不良反应,限制了药物发挥疗效。临床化疗迫切要求提高紫杉醇药物的生物利用率,减少其对机体的毒副作用。 本研究利用对细胞无毒害作用的两亲性生物降解嵌段共聚物聚乙二醇-聚(乳酸-碳酸酯)(简称为PEG-b-PLA)作为药物载体与紫杉醇共价键合,形成高分子-紫杉醇纳米胶束微球(M(PTX)),然后与结合有叶酸(FA)或促黄体素释放激素(LHRH)的FA-PEG-b-PLA或LHRH-PEG-b-PLA以一定的体积比混合,自组装形成高分子靶向聚合物--叶酸紫杉醇纳米胶束(FA-M(PTX))和促黄体素释放激素紫杉醇纳米胶束(LHRH-M(PTX))。FA或LHRH紫杉醇纳米胶束微球在水溶性介质中可以形成“壳-核”结构,将脂溶性的紫杉醇包裹其中,FA或LHRH配体位于“壳-核”表面。“壳-核”结构降低了紫杉醇纯药和溶媒带来的不良反应,增加了药物的稳定性和恒量缓释功能。根据肿瘤组织高表达叶酸受体和卵巢组织高表达促黄体素释放激素的组织特点,借助配体—受体特异性高效率结合的生物学特性,以叶酸(FA)或促黄体素释放激素(LHRH)为导向,起到靶向给药的作用。提高了药物的生物利用率,有望成为可用于临床的新剂型化疗药物。 目的: 探讨叶酸靶向紫杉醇胶束(FA-M(PTX))和促黄体素释放激素靶向紫杉醇胶束(LHRH-M(PTX))在细胞水平对卵巢上皮性癌SKOV3细胞的细胞毒性作用和诱导细胞凋亡的能力,研究(FA-M(PTX)在荷瘤动物体内抑制恶性肿瘤生长的效果。 方法: 采用溶液聚合法合成高分子聚合物胶束药物,利用高效液相色谱法(HPLC)观察其生物释放行为。在细胞水平采用四氮唑(MTT)法检测高分子聚合物胶束药物对卵巢癌SKOV3细胞的毒性作用;并利用流式细胞仪(FCM)检测其诱导肿瘤细胞凋亡的能力。利用裸鼠制作人卵巢癌SKOV3荷瘤动物模型;观察荷瘤动物对高分子聚合物胶束药物的耐受性。利用SKOV3荷瘤动物模型观察高分子聚合物胶束药物对荷瘤裸鼠的生存时间的影响和对肿瘤生长的抑制作用;并用免疫组织化学方法研究高分子聚合物胶束药物对肿瘤杀灭作用以及用免疫组织化学方法和流式细胞仪(FCM)检测研究高分子聚合物胶束药物诱导小鼠体内肿瘤组织细胞凋亡的效果。 结果: 1.利用两亲性嵌段共聚物PEG-b-P(LA-co-MCC)与PTX缩合得到了PTX键合高分子药物PEG-b-P(LA-co-MCC/PTX),每条高分子链上平均带有1.5个PTX。PTX胶束药物的体外释放实验显示,PTX胶束在24小时累积释放量达到49.1%,72小时达到70.5%,144小时达到79.7%,表明PTX胶束在最初的24小时释放速度较快,72小时呈现连续缓慢释放,符合我们所预期的结果。PEG-b-P(LA-co-MCC/PTX)与带有叶酸的FA-PEG-b-PLA或促黄体素释放激素的LHRH-PEG-b-PLA按照9:1的重量比制备了混合胶束叶酸紫杉醇纳米胶束和促黄体素释放激素紫杉醇纳米胶束。DLS检测到三种胶束M(PTX)、FA-M(PTX)和LHRH-M(PTX)的粒径分别为95nm、110nm和127nm。其中,两种靶向共轭高分子胶束药物也呈球形,有利于载药胶束的靶向蓄积。 2.在细胞水平,本研究合成的胶束载体部分对培养细胞没有毒副作用,细胞呈现梭形、星形,细胞核位于中央;细胞伸出伪足相互连接,增殖旺;细胞密集区域可见细胞接触性抑制。紫杉醇单品作用SKOV3细胞24小时时出现明显的细胞毒性:细胞明显回缩变圆,变小,细胞分裂减少,胞浆内出现粗糙的颗粒,部分细胞形态破坏,可见细胞内容物释出。紫杉醇胶束、叶酸紫杉醇胶束和促黄体素紫杉醇胶束作用24小时后,仅部分SKOV3细胞出现细胞毒性;作用72小时时,大部分细胞死亡。在紫杉醇浓度为10g/ml时,24小时内各种紫杉醇制剂对细胞的抑制作用没有差异;随着紫杉醇浓度降低,紫杉醇胶束的三种剂型对癌细胞的抑制率低于紫杉醇单品,P 0.05。在作用48小时及以后,紫杉醇胶束对卵巢癌细胞的抑制作用显著低于同浓度的紫杉醇单品。但随着药物浓度的增加及作用时间的延长,紫杉醇胶束的三种剂型对SKOV3细胞生长的抑制率与紫杉醇趋于一致,三种不同剂型的聚合物胶束药物对SKOV3细胞的抑制率达到78~87%。在四种紫杉醇药物对SKOV3细胞作用72小时后监测其对凋亡的诱导作用发现,紫杉醇胶束M(PTX)、叶酸紫杉醇胶束FA-M(PTX)和促黄体素释放激素紫杉醇胶束LHRH-M(PTX)的凋亡率显著高于PTX组(P0.05)。 3.在动物体内实验M(PTX)和FA-M(PTX)治疗组的裸鼠同生理盐水治疗组的裸鼠一样,无不良反应;注射临床用PTX的裸鼠出现尖叫、撕咬、抽搐、躁动的现象,且该组动物在给药后3-4天内出现食欲不振、体重减轻等不良反应。通过生存实验观察,M(PTX)和FA-M(PTX)可使荷瘤动物的中位生存时间(分别为55天和69天)显著高于对照动物(49天)和PTX治疗动物(50.5天)。通过体积测量对照组、PTX组、M(PTX)组和FA-M(PTX)组的裸鼠肿瘤增长率分别为87.6%、10.3%、6.7%和-27.1%,给药组与生理盐水对照组相比均有显著差别,FA-M(PTX)治疗组肿瘤增长率明显低PTX和M(PTX)治疗组;PTX组、M(PTX)组和FA-M(PTX)组肿瘤瘤重抑制率分别为33.3%、57.7%和70%,M(PTX)和FA-M(PTX)治疗组在对瘤重的抑制上显著高于PTX治疗组。免疫组化法检测肿瘤组织中凋亡蛋白的表达情况显示:生理盐水、PTX、M(PTX)和FA-M(PTX)组Bax蛋白的表达阳性率分别为12.5%、50.0%、66.6%和77.8%,Bcl-2蛋白的表达阳性率分别为75.0%、62.5%、44.4%和22.2%,Caspase-3蛋白的表达阳性率分别为25.0%、62.5%、66.6%和77.8%,组间差别显著;FCM法检测肿瘤细胞凋亡率分别为17.4%、41.7%、46.6%和49.7%,两种胶束紫杉醇M(PTX)和FA-M(PTX)促凋亡的效果显著优于临床用市售PTX,P 0.05。 结论: 1.高分子键合药在水溶性介质中呈现连续缓慢释放过程; 2.靶向紫杉醇胶束与紫杉醇一样,对卵巢癌细胞有显著的细胞毒作用,可引起肿瘤细胞死亡; 3.在细胞水平M(PTX)、FA-M(PTX)和LHRH-M(PTX)的细胞毒性作用不如紫杉醇单品;在荷瘤动物体内FA-M(PTX)对肿瘤细胞SKOV3细胞毒性作用强于紫杉醇单品; 4.FA-M(PTX)与PTX相比具有较低的毒副反应,动物耐受性强; 5.FA-M(PTX)在荷瘤动物体内对卵巢癌细胞具有更好的抑制作用,更显著地延长了动物的生存期; 6.FA-M(PTX)同紫杉醇单品相比诱导卵巢癌细胞凋亡的作用更强。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R737.31

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