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《吉林大学》 2012年
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蛋白酶体抑制剂对胶质瘤细胞诱导凋亡作用及机制研究

范文海  
【摘要】:胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤,约占40%-50%,肿瘤呈浸润性生长,手术往往难以彻底切除,术后复发率高。其中胶质母细胞瘤恶性度最高,预后最差,平均生存期不超过1年。胶质瘤现在的治疗方案,仍然是手术治疗为主,不能够手术的,采取放射治疗和化学治疗;或者术后结合放、化疗。随着神经外科的发展,特别是神经导航及术中MRI的应用,使得手术切除更彻底、更安全,但仍未解决复发问题。化学治疗是治疗胶质瘤的重要手段,但疗效不能令人满意,这也提示胶质瘤的化疗还有很大提升空间,值得去努力探索,寻找更好、更有效的化疗药物就成了胶质瘤治疗研究的重要方向。 泛素-蛋白酶体系统是细胞内重要的蛋白质水解系统,主要选择性降解细胞内的异常蛋白质和许多细胞调节蛋白,广泛参与调控细胞代谢、分化和增殖,与肿瘤发生发展密切相关。因此,抑制蛋白酶体活性已成为一种新的恶性肿瘤治疗策略。蛋白酶体抑制剂能够与20S蛋白酶体的酶解活性位点相结合,阻断蛋白酶体对靶蛋白的降解。抑制蛋白酶体的活性能够抑制多种肿瘤细胞的增殖,包括黑色素瘤、前列腺癌细胞和神经胶质瘤细胞,但其基本机制还未完全阐明。基于此,我们通过实验来探讨蛋白酶体抑制剂MG-132诱导胶质瘤细胞凋亡的内在机制。 氧化应激是一个复杂的动态过程,是由于过多的活性氧不能被细胞清除引起的,是细胞和机体常见的损伤。对氧化应激基本防御机制是通过细胞内抗氧化系统直接淬灭活性氧,蛋白酶体通过降解异常蛋白来提供第二级防御。氧化应激损伤大分子如脂类、核酸和蛋白质,通过活性氧影响信号传导诱导细胞死亡。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡,是Caspase酶依赖的多级酶联反应过程。氧化应激可能通过凋亡途径导致细胞死亡。多项研究表明,氧化应激与蛋白酶体密切相关,因为蛋白酶体选择性降解氧化应激破坏蛋白并参与调节多种抗氧化酶。然而,蛋白酶体功能障碍与氧化应激之间的关系还没弄清楚。在中枢神经系统内,蛋白酶体功能障碍是一个重要的诱导氧化应激的开关。本实验通过研究蛋白酶体抑制剂MG-132对C6胶质瘤细胞增殖的影响,来探讨MG-132诱导的细胞凋亡和因抑制蛋白酶体活性而引起的氧化应激之间的关系。应用tiron来阻断蛋白酶体抑制剂诱发的氧化应激。 MG-132属于合成的肽醛类抑制剂,能可逆地抑制蛋白酶体的糜蛋白酶样活性,阻断蛋白酶体对靶蛋白的降解。鼠C6胶质瘤细胞和人脑胶质母细胞瘤的病理学特征一致,也呈浸润性生长。故本实验选用了蛋白酶体抑制剂MG-132和鼠C6胶质瘤细胞。应用MTT、流式细胞仪、荧光显微镜、透射电子显微镜、Succinyl-LLVY-AMC测定蛋白酶体活性、DCFH-DA评估ROS、Western Blotting等方法,并应用tiron探讨氧化应激和C6胶质瘤细胞增殖抑制二者间的关系,通过实验研究了MG-132对C6胶质瘤细胞增殖影响及其作用机制。结果表明,蛋白酶体抑制剂MG-132能通过诱导C6胶质瘤细胞凋亡而抑制其增殖,并呈时间依赖和剂量依赖的关系。MG-132通过氧化应激途径诱导C6胶质瘤细胞凋亡。MG-132的剂量为18.5umol/L时,作用3小时就能抑制约70%蛋白酶体的活性。MG-132通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2和XIAP水平,上调促凋亡蛋白Bax和caspase-3,使PARP多肽裂解为无活性的85kDa片段,能有效地通过诱导C6胶质瘤细胞凋亡而抑制其增殖。同时细胞内活性氧的增加超过5倍。MG-132作用C6胶质瘤细胞导致氧化应激产生大量ROS,并呈时间依赖性增加。应用Tiron不仅能够有效地阻断MG-132诱导的氧化应激,还能抑制MG-132对C6胶质瘤细胞的增殖抑制和凋亡诱导,并逆转凋亡相关蛋白的表达。Tiron能降低Bax和caspase-3的表达,减弱Bcl-2和XIAP表达的下调,明显降低PARP的裂解,tiron通过这些途径来抑制MG-132诱导细胞凋亡。这些结果表明MG-132诱导的氧化应激和细胞凋亡之间存在着因果关系,抑制蛋白酶体的活性导致C6胶质瘤细胞通过氧化应激诱导其凋亡,揭示了蛋白酶体抑制剂导致胶质瘤细胞凋亡的上游机制事件。 总之,通过实验研究表明,抑制蛋白酶体活性对胶质瘤细胞有增殖抑制作用、并通过氧化应激作用诱导其凋亡,为未来应用蛋白酶体抑制剂治疗胶质瘤提供了实验和理论基础。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R739.41

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