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《吉林大学》 2012年
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理性设计提高嗜热酯酶对有机磷化合物的敏感性

王跃溪  
【摘要】:利用酯酶作为有机磷农药的生物检测剂,在环保和食品安全等方面有着重要的作用,其检测方便,灵敏度高等特点为其广泛应用于有机磷化合物(OPs)残留物的检测,提供了重要的依据。用乙酰胆碱酯酶(AChE)检测有机磷农药,己不单单只停留在实验阶段,市场上已有许多利用AChE而开发的农药检测试剂盒,但哺乳动物来源的AChE稳定性较差,限制了其应用,所以开发新型的生物检测剂成为了生物工程领域和工业应用领域的研究热点。本文以具有高度热稳定性的嗜热酯酶作为研究对象,对其与OPs反应的抑制反应机理等进行了系统的研究。 我们以来源于嗜热菌Archaeoglobus fulgidus的嗜热酯酶AFEST作为研究对象,测定了其与7种结构不同的OPs的抑制反应。通过与农药检测试剂盒中的AChE的比较,证实了AFEST对有机磷化合物具有一定的敏感度,但广谱性较低。随后我们通过对AFEST结构的分析,选择突变位点,成功的构建了双点突变体N44S/S48V。突变体N44S/S48V对7种OPs的敏感度均有所提高,而且对其中4种的敏感度已经超越了AChE。突变体拓宽了AFEST能敏感反应的OPs的种类,为AFEST能成功取代AChE,作为OPs生物感受器奠定了基础。在本实验中,通过定点突变、酶抑制动力学和计算生物学等手段,加深了我们对酶结构与功能的关系的理解,为我们更进一步的研究酶与抑制剂作用机制,以及获得对OPs更加敏感的突变体提供了重要信息。 为提高酶的重复利用率,我们以硝酸纤维素微孔滤膜(NC膜)为载体对AFEST进行了固定化。该固定化酶具有良好的反应稳定性和贮存稳定性,其反复利用率可达100次,为其产业化应用奠定了基础。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:X830.2;X172

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【参考文献】
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