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《吉林大学》 2012年
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几类重要酶的催化反应机理的理论研究

李雪  
【摘要】:酶是由活细胞产生的具有催化功能的蛋白质。它属于生物大分子,但只有很小的部分起到结合底物或催化反应的作用,称为酶的活性中心。在酶催化过程中,底物或底物类似物在酶的活性中心瞬间生成酶-底物复合物,这个复合物具有较高的能量,是一种极为不稳定的状态。这种瞬间的状态很难通过实验方法来捕获。计算机模拟的出现有力的弥补了实验上的不足,能够从原子水平上获得整个反应历程的详细信息。通过分析酶催化反应的中间体和过渡态的结构,并结合动力学方法确定反应的限速步骤,就能够推知整个反应的催化机理。 本文主要利用量子化学计算方法,基于从蛋白质晶体结构中截取的团簇模型,对N~5-羧基氨基咪唑核苷酸变位酶、α-甲酰基辅酶A消旋酶和谷胱甘肽硫转移酶这三个体系进行了催化机理的理论研究。主要结果如下: 1.N~5-羧基氨基咪唑核苷酸变位酶催化的重排反应 对于除原生动物外的所有生命体来说,从头合成嘌呤这一过程都至关重要。在Class I PurE催化下生成5-氨基-4-羧基咪唑核苷酸(CAIR)这一反应是整个嘌呤合成过程中的关键步骤。遗传研究表明,Class I PurE对微生物的生长必不可少。这种酶的缺失会导致嘌呤缺陷体,在人类和鼠的血清中,这种缺陷体不具备繁殖能力,也没有抵御疾病的能力。 本文利用密度泛函理论B3LYP方法对N~5-羧基氨基咪唑核苷酸变位酶催化的重排反应机理进行了理论研究。基于EcPuE的晶体结构,我们构建了包含93个原子的理论模型来研究其催化机理,并利用自然键轨道理论(NBO)方法进行了电荷布居分析,进一步验证推测机理的正确性。结果表明,此重排反应分脱羧和羧化两个步骤进行。His45是一个既能起到广义酸作用又能起到广义碱作用的催化残基。在计算过程中,我们得到一个具有四面体结构的中间体(iso.CAIR),从理论上证实了之前实验上对该结构的预测。根据对每个优化结构的能量计算,绘制出总反应的势能面曲线,通过比较,AIR的羧化反应步骤为整个反应的限速步骤。同时,我们也考察了其它重要氨基酸残基(Ser43,Ala44, His45, Gly71, His75和Leu76等)对催化反应的影响。 2.α-甲酰基辅酶A消旋酶催化机理的理论研究 支链脂肪酸是人类日常饮食中的重要成分,也被用于非类固醇抗炎药物,如布洛芬。在代谢过程中,只有S构型底物能够通过支链脂酰辅酶A氧化酶发生代谢作用。α-甲酰基辅酶A消旋酶(AMACR)能够使各种α-甲酰基辅酶A衍生物发生S、R异构互变。因此,AMACR的这一功能使其成为必需酶。研究发现它在乳腺癌、直肠癌和卵巢癌中存在过表达现象。此外,AMACR是前列腺癌的高度敏感及特异的标志物,在前列腺癌的早期诊断中具有十分重要的临床应用价值。 在本文中,我们对来源于结核分枝杆菌的α-甲酰基辅酶A消旋酶(MCR)进行了深入研究。它与人类的氨基酸序列有着高达43%的同源性。计算选用B3LYP方法,结构的优化和单点能的计算分别在6-31G(d)和6-311++G(2d,2p)两个基组水平上完成。计算结果阐明了MCR催化反应的机理,支持Prasenjit Bhaumik等人通过实验方法预测的结果。在1,1-质子转移反应中,His126和Asp156作为广义碱和广义酸催化反应的进行。从优化的结构中可以看出,去质子反应后产生的中间体为平面烯醇负离子式,因此烯醇式或烯酮式的中间体构型被排除。通过对能垒的比较,我们认为在从S-异构体向R-异构体转变的过程中,去质子化步骤是整个消旋反应的限速步骤。应用理论方法详细地描述酶促反应的路径,将对基于过渡态结构设计和研发抗癌药物提供有力的帮助。 3.谷胱甘肽(GSH)激活机理的理论研究 谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)能够引起亲电类毒性物质的代谢,因此谷胱甘肽硫转移酶具有重要的解毒作用。GSTs是通过催化谷胱甘肽(GSH)与一系列亲电类的毒性物质发生反应,生成无毒的可溶性物质,之后被排除细胞外以达到解毒目的。但是,它对药物的代谢会产生抗药性问题,导致临床治疗的失败。GSH在与亲电试剂反应之前首先要被激活为硫醇离子的形式。关于典型的GSTs—GSTA1-1, GSTP1-1和GSTM1-1中GSH的激活机理已经有了广泛的研究。而非典型的GSTs—Gtt2的激活机理研究尚未见报道。 本文应用Gaussian 03程序,采用B3LYP方法完成所有的几何构型优化、频率分析和能量计算,推测出新型谷胱甘肽硫转移酶Gtt2中谷胱甘肽(GSH)的激活机理。本文提出的GSH激活机理与实验假设相一致,并且从能量角度证明了该机理的合理性。在反应过程中,His133作为广义碱、水分子作为助催化剂。通过与典型GSTs的比较,分析了产物具有较高能量的原因。我们在计算过程中选取了两个模型,分别含有不同数量的水分子,考察了体系中水分子对GSH激活机理的影响。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:O643.32

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【参考文献】
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