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乳清抗氧化肽的工艺探索与活性分析

朴姗善  
【摘要】:生物活性肽作为对人体健康具有重要促进作用的功能因子已成为当前国内外最热门的研究课题。以乳蛋白为原料制备的生物活性肽在具有功能性的同时还可以提供额外的营养价值,因此具有相当的发展前途。乳源抗氧化肽是一种具有清除自由基,抑制脂质过氧化能力的天然活性肽。对其进行深入的研究,在食品防腐、疾病防治、延缓衰老以及功能食品研发方面具有重要意义。 干酪生产过程中会析出大量的乳清,其主要成分为乳清蛋白。乳清蛋白中的氨基酸种类齐全,含量丰富,营养价值很高。利用乳清制备抗氧化肽可将干酪生产的副产物变废为宝,充分利用乳清的营养成分,减少了环境污染;乳清活性肽增加乳制品的附加价值,可作为功能保健食品的开发,具有很高的健康效益和经济效益,从而促进了乳品工业的发展。 本研究以乳清浓缩蛋白粉(WPC80)为原料,对乳清抗氧化肽的制备工艺进行了探索,对其工艺条件进行优化;对制备的乳清抗氧化肽进行超滤分离并对其抗氧化活性进行了分析。主要结果如下: ⑴设计了利用胰蛋白酶酶解乳清蛋白制备抗氧化肽的工艺流程,通过单因素实验,以DPPH自由基的清除率为测定指标,确定了乳清蛋白酶解物最佳工艺条件为:底物浓度3%(W:V),酶解时间90min,酶解温度50℃,pH值:8.0,加酶量:2%,在此基础上,进行进一步的优化,确定最佳的酶解条件。 ⑵筛选出3个对乳清蛋白酶解物抗氧化活性影响较大的重要因素:反应温度(A)、pH值(B)、加酶量(C),利用Box-Behnken响应面实验得到回归方程:Y(DPPH自由基清率)=45.79-4.32A+2.91B-1.42C+3.71AB+3.21AC+0.43BC-6.57A2-5.08B2-5.66C2。在此基础上确定了三者的最佳值:控制酶解温度:48.31℃,pH值:8.08,加酶量:1.78%,酶解产物对DPPH自由基清除率的理论值为46.90%,对结果进行验证实验,得清除率为47.76%,证实结果准确、可靠,具有统计学意义。 ⑶设计了微生物法制备乳清抗氧化肽的工艺流程,将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的培养24h后,以1:1的比例接种于乳清蛋白复原液中制备具有较强自由基清除能力的多肽。通过单因素实验,以DPPH自由基的清除率为测定指标,确定了乳清蛋白发酵产物最佳工艺条件为:10%乳清复原液,发酵时间:24h,发酵温度:37℃~47℃,初始pH值:6.0~6.8,接种量:3%~5%,在此基础上,进行进一步的优化,确定最佳的发酵条件。 ⑷筛选出3个对乳清蛋白发酵产物抗氧化活性影响较大的重要因素:反应温度(A)、初始pH值(B)、接种量(C),利用L9(33)正交表进行培养优化实验方法,得到最佳的发酵培养条件:10%乳清蛋白复原乳在37℃,初始pH值6.8,接种量4%条件下发酵24h。在该条件下,发酵产物对DPPH自由基的清除率为66.95%。 ⑸对乳清蛋白酶解产物和乳清蛋白发酵产物进行了超滤分离,测定了不同相对分子质量的分级产物的抗氧化活性,确定了经截留相对分子质量为5KDa的膜片分离后,产物对DPPH自由基的清除率最高。对经过5KDa膜片超滤后的乳清蛋白酶解产物和乳清蛋白发酵产物进行了抗氧化活性的对比,发现发酵产物的抗氧化活性相对更高,对DPPH自由基清除率可达到79%,同时分析了造成这种现象主要是由商品酶的特异性和乳酸菌蛋白质酶系的多样性造成的。 ⑹经Tricine-SDS-PAGE电泳测定,乳清发酵产物具有抗氧化活性的小肽其分子量集中于小于2KDa范围内;而氨基酸分析仪的分析结果证明这些多肽中含有与抗氧化活性大小关系密切的疏水性氨基酸、芳香环氨基酸占总氨基酸含量的70%以上,显现显著的抗氧化活性。同时富含人体和儿童所需的必需氨基酸,营养成分丰富,适宜作为功能性食品的开发。 ⑺根据酶法和微生物法实验内容并结合国内外的相关研究报道,从工艺原理、工艺条件和最终产品的性质等方面对酶法和微生物法这两种制备乳清抗氧化肽的工艺进行了综合客观且全面的对比评价,得到微生物法制备乳清抗氧化肽在功能性食品的研发方面显示出一定的优势的结论,并由此对乳清抗氧化肽功能食品的研发进行了合理的展望。 ⑻对乳清抗氧化肽的活性进行对比分析,发现实验室利用微生物法制备的乳清蛋白发酵产物的抗氧化活性明显高于乳清原液和市售凝固型酸奶;市售酸奶亦现实出一定的抗氧化活性,乳清原液抗氧化活性较低。引导我们在未来利用乳清研发一种具有抗氧化活性的功能饮料产品,而如何在较低成本的前提下提高乳清蛋白或其产生多肽的浓度是成功的关键。


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