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《吉林大学》 2012年
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松材线虫休眠相关基因daf-3、daf-9、daf-12、daf-16的克隆及其功能研究

王殿东  
【摘要】:松材线虫,学名Bursaphelenchus xylophilus (SteinerBuhrer),异名Bursaphelenchus lignicolus (Mamiya YKiyohara)是一种重要的检疫性外来入侵物种,通过松墨天牛进行传播,是松属树种的毁灭性病害,给亚洲多个国家和地区造成巨大的经济损失。松材线虫的生活史分为繁殖阶段和扩散阶段,在特定条件下这两个阶段可以相互转换。这种特性有利于松材线虫在不良环境条件下保持较高的存活率,也有利于松材线虫随天牛传播扩散,但这种转换机制尚不明确。为了明确松材线虫繁殖型和扩散型转换的机制,本研究根据模式线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhadits elegans)的滞育机制,以模式线虫滞育相关基因为基础,从松材线虫中克隆相关基因daf-3、daf-9、daf-12和daf-16,并分析基因在不同虫态和环境条件下的表达模式,并利用农杆菌介导灰葡萄孢菌表达松材线虫基因dsRNA的技术,敲低松材线虫daf-3、daf-9、daf-12、daf-16-1、daf-16-2基因的表达,并对其发育、繁殖量、寿命、脂肪积累等性状进行了统计,初步确定基因对松材线虫滞育的影响和作用,同时建立原生质体转化体系,成功敲除灰葡萄孢菌的Dicer-1基因,为以喂饲法介导RNA干扰研究松材线虫功能奠定基础。主要研究结果如下: 1.采用RACE法从松材线虫中克隆与秀丽隐杆线虫滞育调控基因同源的daf-3、daf-9、daf-12和daf-16基因(daf-9、daf-12和daf-16基因登录号分别为GU256938、GU584879、JN628938、GU584878)。其中daf-3基因由9个外显子和8个内含子组成,属于MH蛋白家族;daf-9基因由6个外显子和5个内含子组成,属于细胞色素P450蛋白家族;daf-12基因含有6个外显子和5个内含子,属于核激素受体(NHR)蛋白家族;daf-16属于FOXO转录因子家族,存在2个基因即daf-16-1和daf-16-2,每个基因有2种剪接方式。在松材线虫基因组中daf-3、daf-9、daf-12和daf-16均为单拷贝基因。蛋白序列比对分析表明,松材线虫daf-3、daf-9、daf-12和daf-16基因分别与其同族基因具有高度保守性。 2.分析了松材线虫繁殖型和扩散型中daf-9和daf-12基因的表达模式。Daf-9和daf-12在松材线虫不同发育时期和不同虫态中均有表达,但是在扩散型和繁殖型线虫中表达量变化较大。基因daf-9在扩散型Ⅲ龄线虫中表达水平极低,仅为繁殖型幼虫的1/10,而在扩散型Ⅳ龄幼虫中的表达量则与繁殖型幼虫持平。基因daf-12在扩散型Ⅲ龄线虫中表达水平与繁殖型幼虫基本持平,而在扩散型Ⅳ龄幼虫中表达量为扩散型Ⅲ龄的20倍以上,说明在松材线虫由繁殖型进入扩散型时daf-9基因大幅度下调,导致daf-12(NHR)缺少配体,而使松材线虫进入并保持扩散型Ⅲ龄。松材线虫此时出现积累脂肪,停止发育等表型,进入扩散型Ⅳ龄后,松材线虫daf-9基因恢复至繁殖型幼虫水平,daf-12基因大幅上调,daf-9利用松材线虫体内的固醇类物质合成DA,为daf-12提供配体。松材线虫由扩散型Ⅲ龄进入扩散型Ⅳ龄后,固醇类物质消耗掉而得不到补充,DA的合成再次被降低,使松材线虫维持扩散型Ⅳ龄幼虫。 3.分析了松材线虫daf-3、daf-9、daf-12和daf-16基因在松材线虫应对外界不良条件(食物缺乏、高温、低温、种群密度增大)的表达模式。在温度适宜、食物充足、种群密度不大的条件下,松材线虫daf-3、daf-9、daf-12、daf-16基因均上调表达;在食物匮乏的情况下,松材线虫daf-3、daf-9、daf-12、daf-16基因均呈下调表达;当种群密度过大时,daf-3、daf-9、daf-12、daf-16基因均上调表达;低温时,daf-3、daf-12、daf-16-1基因呈上调表达,daf-9、daf-16-2基因呈下调表达;高温胁迫下,除daf-16-1基因略下调外,其它基因均上调表达。Daf-16-2蛋白在食物匮乏和低温胁迫下,大幅下调表达,而高温胁迫对其影响不大。 4.构建了农杆菌介导转化在丝状真菌中表达dsRNA的载体PHD-RH,并利用灰葡萄孢菌介导表达松材线虫daf-3、daf-9、daf-12、daf-16-1、daf-16-2以及非靶性的sGFP基因的dsRNA,分别这些菌株连续培养松材线虫10代后(以转空载体的菌株为对照),分析松材线虫靶标基因表达量、发育速度、繁殖量、寿命、脂肪积累等表型。经过连续10代的RNAi处理松材线虫的靶标基因表达量下调近20倍,而sGFP基因dsRNA对靶标基因的表达没有影响;经daf-9、daf-12、daf-16-2基因RNAi处理后松材线虫发育速度显著低于对照(空载体),而经其它基因RNAi处理的线虫对其发育速度无影响;daf-9、daf-12基因RNAi处理的线虫繁殖量显著减少,而daf-16-1和daf-16-2RNAi处理的线虫繁殖量显著增加,经daf-3和sGFP基因RNAi处理的线虫对其繁殖量无影响;经daf-9、daf-12、daf16-1基因RNAi处理的线虫寿命显著增高,经daf-3、daf16-3、sGFP基因RNAi处理的线虫对其寿命无影响;经daf-3、daf-9、daf-12、daf16-1、daf-16-2基因RNAi处理的线虫脂肪含量均显著高于对照,而sGFP基因RNAi对松材线虫的脂肪积累量没有影响。 5.建立灰葡萄孢菌原生质体转化体系,对灰葡萄孢菌Dicer-1基因进行同源敲除,获得了Dicer-1基因功能缺失的灰葡萄孢菌突变体,为更近一步利用灰葡萄孢菌表达松材线虫基因dsRNA研究松材线虫基因功能奠定了基础。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S763

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 赵博光,郭道森;松材线虫携带的一株细菌分离及其致病性[J];北京林业大学学报;2004年01期
2 宋世涵,张连芹,陈沐荣,魏小琴,王炳真,杨亮,谢诚,陈纪文;利用管氏肿腿蜂防治松材线虫病的研究[J];广东林业科技;1998年03期
3 谢丙炎;成新跃;石娟;张青文;戴素明;成飞雪;骆有庆;;松材线虫入侵种群形成与扩张机制——国家重点基础研究发展计划“农林危险生物入侵机理与控制基础研究”进展[J];中国科学(C辑:生命科学);2009年04期
4 莫明和,李国红,董锦艳,张克勤,刘美华;日本亮耳菌──一种新的杀线虫真菌[J];菌物系统;2000年04期
5 谈家金;向红琼;冯志新;;松材线虫伴生细菌的分离鉴定及其致病性[J];林业科技开发;2008年02期
6 赵博光;梁波;徐梅;赵林果;;松材线虫携带的一株荧光假单胞细菌致萎毒素的初步分离[J];林业科学;2006年01期
7 张连芹,宋世涵,黄焕华,范军祥,崔锡明;利用引诱剂和肿腿蜂防治松墨天牛的研究[J];林业科学研究;1991年03期
8 赵博光,郭道森,高蓉,郭建;细菌分离物B619与松材线虫病关系的初步研究[J];南京林业大学学报;2000年04期
9 郭道森,赵博光,高蓉;利用愈伤组织验证细菌分离物B619与松材线虫病的关系[J];南京林业大学学报(自然科学版);2001年05期
10 曹越,沈伯葵;人工培养条件下松材线虫提取物的毒性研究[J];南京林业大学学报;1996年04期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李瑞;;松材线虫伴生细菌与松树萎蔫病关系的初步研究[J];山东农业科学;2010年04期
2 程剑明;江勇;徐金华;;松材线虫人工培养研究进展[J];安徽林业科技;2009年03期
3 高景斌;冈村政则;;松树抗病育种研究进展[J];安徽农业科学;2008年31期
4 田艳;张宏;张真;张力;孔祥波;;重庆市松褐天牛引诱剂对比试验[J];安徽农业科学;2008年32期
5 陈利星;陈绘画;周钦富;;气象因子对短角幽天牛诱捕效果的影响[J];安徽农业科学;2009年31期
6 王为民;周钦富;张建华;张中国;;气象因子对马尾松角胫象诱捕效果的影响研究[J];安徽农业科学;2010年10期
7 黄麟;许剑涛;付涵予;吴小芹;叶建仁;;松材线虫和拟松材线虫14-3-3蛋白基因全长cDNA克隆与分析[J];安徽农业科学;2011年36期
8 王利生;陈叶平;周铖;袁燕飞;;嵊泗县松材线虫病综合防治及迹地更新现状[J];现代农业科技;2010年04期
9 秦复牛,潘沧桑;松材线虫病研究进展(综述)[J];安徽农业大学学报;2003年04期
10 束庆龙;汤坚;黄长春;杨光道;;松树泌脂速度对松材线虫病的抗性影响[J];安徽农业大学学报;2006年01期
中国重要会议论文全文数据库 前6条
1 张佐双;程炜;熊德平;;管氏肿腿蜂对古柏树的双条杉天牛防治技术研究与应用[A];北京奥运和城市园林绿化建设论文集[C];2002年
2 钱明惠;;管氏肿腿蜂中间寄主繁育及繁蜂技术初步研究[A];走向21世纪的中国昆虫学——中国昆虫学会2000年学术年会论文集[C];2000年
3 朋金和;郭良红;吕传海;卜厚平;马盛安;李玉芬;;PA型诱木引诱剂防治松褐天牛林间应用技术研究[A];昆虫与环境——中国昆虫学会2001年学术年会论文集[C];2001年
4 黄金水;汤陈生;杨希;何学友;陈金渭;黄炳荣;林庆源;康文通;;福建省松材线虫病监测及持续控制技术研究[A];第二届中国林业学术大会——S6 森林昆虫与自然调控论文集[C];2009年
5 贲爱玲;郑敬荣;朱若箐;韩正敏;;中国日本松材线虫虫株对不同松苗的致病性及在树体内移动特点比较[A];江苏省植物病理学会第十一次会员代表大会暨学术研讨会论文集[C];2008年
6 乔飞;陈京元;桂连友;;松墨天牛引诱剂的研究与应用[A];华中昆虫研究(第五卷)[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 田雪亮;松材线虫和拟松材线虫伴生细菌多样性及生态功能研究[D];西北农林科技大学;2010年
2 朱旺生;城市绿地系统树种规划研究[D];南京林业大学;2011年
3 楼妙苗;洋葱伯克氏菌在竹子和桑树根围的基因型多样性及其致病性以及壳聚糖抑制B.seminalis机理研究[D];浙江大学;2011年
4 石娟;浙江松林生态系统对松材线虫入侵的抵御和恢复机制[D];北京林业大学;2005年
5 张昕;植物病原拮抗细菌的发酵条件作用机制及定殖规律的研究[D];浙江大学;2005年
6 陈凤毛;松材线虫SCAR标记与分子检测技术[D];南京林业大学;2005年
7 张翌楠;松褐天牛的天敌昆虫调查及生物防治技术研究[D];中国林业科学研究院;2006年
8 李兰英;浙江省松材线虫病环境影响经济评价与治理研究[D];北京林业大学;2006年
9 刘海军;中国输美木包装携带重要钻蛀性害虫的风险评价[D];北京林业大学;2006年
10 宋冀营;浙江松材线虫侵染后松林钻蛀性昆虫群落结构和功能[D];北京林业大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王仕利;松材线虫乙酰胆碱酯酶ace-2基因的cDNA克隆与序列分析[D];中南林业科技大学;2009年
2 代玲玲;松材线虫及近缘种热激蛋白90基因的分子特征及其高温适应性研究[D];中国农业科学院;2011年
3 姜静;栗山天牛生物学特性及成虫期防治技术研究[D];中国林业科学研究院;2011年
4 史延梅;几种松树寄生线虫种类鉴定与致病性研究[D];南京林业大学;2011年
5 张明艳;利用RNAi沉默橘小实蝇生殖相关基因的研究[D];华中农业大学;2011年
6 吴佳;苏云金芽孢杆菌毒杀松材线虫活性研究及线虫冷冻保存[D];浙江农林大学;2011年
7 汪碧丽;奉化市溪口风景区松材线虫病综合防治技术研究[D];浙江农林大学;2011年
8 任慧杰;松材线虫纤维素酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达、纯化和性质研究[D];青岛大学;2011年
9 张灿;松材线虫和拟松材线虫食道腺及分泌颗粒超微结构的比较研究[D];河北师范大学;2002年
10 王玲萍;松材线虫病媒介昆虫——松墨天牛的研究[D];福建农林大学;2002年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 初冬,刘篆芳,张庆贺;云杉小黑天牛在火烧迹地扩散蔓延的规律[J];北京林业大学学报;1990年04期
2 赵博光,郭道森;松材线虫携带的一株细菌分离及其致病性[J];北京林业大学学报;2004年01期
3 石娟,骆有庆,曾凡勇,陈卫平,严晓素,蒋平;松材线虫入侵对马尾松林主要种群生态位的影响[J];北京林业大学学报;2005年06期
4 宋冀营,骆有庆,石娟,严晓素,陈卫平,蒋平;松材线虫染病松树上钻蛀性昆虫生态位的研究[J];北京林业大学学报;2005年06期
5 石娟;骆有庆;武海卫;严晓素;陈卫平;蒋平;;松材线虫入侵对马尾松林植物群落功能的影响[J];北京林业大学学报;2007年05期
6 邵景文,郑元瑞,李坚,梅红军,高恩柱;云杉小黑天牛生物学特性的研究[J];东北林业大学学报;1990年03期
7 谈家金,叶建仁;松材线虫病致病机理的研究进展[J];华中农业大学学报;2003年06期
8 莫明和,李国红,董锦艳,张克勤,刘美华;日本亮耳菌──一种新的杀线虫真菌[J];菌物系统;2000年04期
9 张连芹,宋世涵,张锷,陈沐荣,徐世多,余海滨,魏小琴,何发,黎桥华;深圳地区松墨天牛综合防治的研究[J];昆虫天敌;1995年01期
10 宁眺,方宇凌,汤坚,孙江华;松材线虫及其关键传媒墨天牛的研究进展[J];昆虫知识;2004年02期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 翟建中,陆玲仙,陈炎莲;象山县松材线虫的分布特征与防治对策[J];浙江林业科技;1992年04期
2 蔡思鸣,叶为民,杨伟东;繁殖松材线虫最佳真菌筛选试验[J];植物病理学报;1994年02期
3 柴希民,蒋平;松材线虫的天敌[J];中国森林病虫;1999年03期
4 周弘,沈培垠;进境木包装松材线虫检疫应把握的关键技术[J];植物检疫;2001年03期
5 周弘,沈培垠;进境木包装松材线虫检疫应把握的关键技术[J];中国检验检疫;2001年01期
6 王斐,申荷丽;日本的抗松材线虫育种研究[J];世界林业研究;2004年06期
7 高景斌,蔡卫兵,徐六一,席启俊,户田忠雄;接种用松材线虫分离种群的筛选[J];林业科技开发;2005年01期
8 王明旭,朱水芳,罗宽,周李华,赵文军;松材线虫rDNA-ITS2的Taq Man探针实时荧光PCR检测[J];林业科学;2005年02期
9 秋原宏;杨大三;;“松材线虫特别防治措施法”的修正及松材线虫危害的新对策[J];湖北林业科技;1984年03期
10 Michael J.Wingfield;隆义华;;美国的一种重要林木病原物—松材线虫[J];湖南林业科技;1984年03期
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1 陈凤毛;叶建仁;吴小芹;;松材线虫两种实用分子检测技术[A];全国生物多样性保护及外来有害物种防治交流研讨会论文集[C];2008年
2 戴素明;肖启明;谢丙炎;;松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)对温度胁迫适应的分子生态机制[A];生物入侵与生态安全——“第一届全国生物入侵学术研讨会”论文摘要集[C];2007年
3 黄启星;成新跃;茆振川;王运生;赵莉蔺;闫霞;Virginia R.Ferris;徐汝梅;谢丙炎;;松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)microRNA组研究[A];第三届全国生物入侵大会论文摘要集——“全球变化与生物入侵”[C];2010年
4 齐文静;闫凡峰;张宗侠;曹阳;刘振宇;;松材线虫乙酰胆碱酯酶的活力测定及基因克隆[A];第三届全国生物入侵大会论文摘要集——“全球变化与生物入侵”[C];2010年
5 陈凤毛;叶建仁;;松材线虫分子检测技术及其推广应用[A];第二届全国生物入侵学术研讨会论文摘要集[C];2008年
6 袁为敏;吴小芹;;松材线虫体内细菌的分离与鉴定[A];第三届中国森林保护学术大会论文摘要集[C];2010年
7 陈艳;詹开瑞;陈明;张晓燕;刘永胜;;溴甲烷对松木片中松材线虫的熏蒸作用[A];第二届全国生物入侵学术研讨会论文摘要集[C];2008年
8 张晓燕;陈艳;詹开瑞;李今中;刘永胜;;环氧乙烷对松木片中松材线虫杀灭作用[A];生物入侵与生态安全——“第一届全国生物入侵学术研讨会”论文摘要集[C];2007年
9 贲爱玲;戚建光;张宏娟;陈玲;韩正敏;;松材线虫与其携带细菌关系[A];第三届全国生物入侵大会论文摘要集——“全球变化与生物入侵”[C];2010年
10 刘桂林;庞虹;周昌清;;我国松材线虫病的研究现状及趋势[A];当代昆虫学研究——中国昆虫学会成立60周年纪念大会暨学术讨论会论文集[C];2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 符王润 通讯员 周飞;松树克星——松材线虫[N];广东科技报;2011年
2 本报记者 宁奎;严控松材线虫传播渠道[N];张家界日报;2011年
3 本报记者 马文生;都是松材线虫惹的祸[N];中国国门时报(中国出入境检验疫报);2002年
4 通讯员陈向 姚丽 记者汤晓峰;国检严防松材线虫“偷渡”[N];南通日报;2010年
5 陈熙同;我多次截获松材线虫[N];国际商报;2001年
6 姜文辉;赵先超;杨诗星;“森林癌症”遇克星[N];中国国门时报;2002年
7 记者 李红梅;严查韩国松材线虫[N];国际商报;2002年
8 记者 孙友 通讯员 孙玉剑;松材线虫威胁我国松林[N];中国绿色时报;2002年
9 本报记者 陈滟;薄片洗涤法越走越远[N];中国国门时报;2010年
10 尚文博 龙琳;严控严防松材线虫 保护国土生态安全[N];中国绿色时报;2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 贲爱玲;松材线虫体表优势细菌的分离及定殖能力研究[D];南京林业大学;2010年
2 张锴;受松材线虫侵染的马尾松抑制消减文库构建与表达谱分析[D];中国林业科学研究院;2010年
3 刘宝军;松材线虫择偶对策及择偶偏向的转录组分析[D];中国林业科学研究院;2014年
4 徐华潮;自然感染松材线虫后黑松与马尾松的病理生理学研究[D];北京林业大学;2013年
5 田雪亮;松材线虫和拟松材线虫伴生细菌多样性及生态功能研究[D];西北农林科技大学;2010年
6 王殿东;松材线虫休眠相关基因daf-3、daf-9、daf-12、daf-16的克隆及其功能研究[D];吉林大学;2012年
7 徐亮;马尾松响应松材线虫侵染的CaM和CaMBP钙信号转导特征[D];北京林业大学;2013年
8 杨洪;松褐天牛Monochamus alternatus Hope生物学特性和交配行为的研究[D];西南大学;2006年
9 王宏毅;伞滑刃属线虫生物多样性与生物地理学[D];福建农林大学;2008年
10 马海宾;松材线虫纤维素酶系及其cDNA基因的克隆与RNA干扰研究[D];中国林业科学研究院;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 苏珊珊;几种重金属暴露对松材线虫的毒性作用[D];河北师范大学;2011年
2 吴佳;苏云金芽孢杆菌毒杀松材线虫活性研究及线虫冷冻保存[D];浙江农林大学;2011年
3 任慧杰;松材线虫纤维素酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达、纯化和性质研究[D];青岛大学;2011年
4 郑海营;具有杀松材线虫活性海洋细菌的分离与鉴定[D];青岛大学;2012年
5 谭晴晴;松材线虫威海群体的发生特点、病原鉴定及药剂毒杀行为研究[D];山东农业大学;2012年
6 齐文静;松材线虫运动行为及其神经递质乙酰胆碱的相关研究[D];山东农业大学;2012年
7 杜婷;松材线虫病原真菌Esteya vermicola生物活性测定及其培养条件的研究[D];中国林业科学研究院;2013年
8 张伟;松材线虫繁殖力和致病性的差异形成及其分子基础[D];安徽大学;2014年
9 樊培峰;杀松材线虫植物提取物的提取与筛选[D];南京林业大学;2010年
10 曾腓力;美国松材线虫携带细菌的生防潜能研究[D];南京林业大学;2010年
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