旋毛虫不同发育时期基因重组蛋白的免疫原性分析及保护性研究

【摘要】：旋毛虫病是一种重要的食源性人兽共患病，可以感染人和100多种哺乳动物，当人类生食或半生食含有感染期幼虫的肉类（如猪肉、马肉等）时，可感染旋毛虫病。在某些国家，由于饮食和烹饪习惯的改变，旋毛虫病被视为一种新兴的或重新出现的疾病，世界不同地区定期有人类感染旋毛虫病疫情的报道。鉴于旋毛虫病对动物饲养和食品安全具有较大的影响，研制可用于人类和家畜的抗旋毛虫感染疫苗将为该病的预防和控制提供一个有价值的工具。 在动物模型中已有基于旋毛虫虫体粗提物、ES产物、减毒沙门氏菌或重组蛋白疫苗的报道。在过去的十年中，已经研究了几种旋毛虫分泌的或与建立寄生/感染有关的蛋白作为重组疫苗的成分，在抗旋毛虫感染方面产生了部分保护作用。然而，由于在宿主中寄生虫抗原在发育期间的变异及多种分子参与寄生过程的建立，单独使用一种蛋白很难产生有效的免疫保护效力，因此，多种抗原联合疫苗可能产生有效的保护。 抵抗病原微生物侵袭最常用的方法是利用其天然抗原或重组蛋白抗原对宿主进行免疫，从而达到对宿主的保护。本实验室已利用感染旋毛虫26天猪血清分别从旋毛虫肠道感染性肌幼虫（inML）、3日龄成虫（Ad3）和新生幼虫（NBL）期cDNA文库中成功筛选得到旋毛虫肠道感染性肌幼虫期半胱氨酸蛋白酶抑制剂类似物基因（Ts-clp）、旋毛虫成虫期丝氨酸蛋白酶基因（Ts-Adsp）和旋毛虫新生幼虫期丝氨酸蛋白酶基因（Ts-NBLsp）；利用感染旋毛虫60天猪血清从旋毛虫肌幼虫（ML）期cDNA文库中筛选获得旋毛虫肌幼虫期丝氨酸蛋白酶抑制剂基因（Ts-serpin）。本研究选用来自旋毛虫不同发育时期cDNA文库中的4种高丰度基因，利用实验室已经成功构建的以pET-28a为载体的4种基因重组表达菌，对其反应原性和免疫原性进行分析，以期研制出高效安全的旋毛虫重组蛋白联合疫苗。 首先，诱导表达4种重组蛋白并利用亲和层析技术进行纯化，经鉴定纯化条带单一且与预期大小相符，利用旋毛虫感染猪、鼠血清对重组蛋白进行鉴定，结果显示，4种重组蛋白均可与旋毛虫感染猪、鼠血清反应，说明旋毛虫不同发育时期基因重组蛋白具有较强的反应原性，可与自然感染和人工感染的旋毛虫抗血清反应。纯化后的4种重组蛋白分别免疫小鼠，制备多克隆抗体，将4种多克隆抗体与旋毛虫ES产物、虫体粗提物抗原反应，结果显示，4种多克隆抗体均可识别天然Ts-clp、Ts-Adsp、Ts-NBLsp和Ts-serpin蛋白。因此，4种重组蛋白均为高反应原性抗原，并且其抗血清可与天然抗原产生免疫反应，对于旋毛虫病的诊断及疫苗的研制具有一定价值。 其次，利用免疫荧光技术分析4种抗原基因的表达特性，结果显示，重组蛋白抗血清在旋毛虫成虫、新生幼虫、肌幼虫虫体表面均有表达，表明4种蛋白参与宿主-寄生虫相互作用，可作为抗旋毛虫疫苗的良好候选抗原。将4种高反应原性抗原与弗氏佐剂乳化后分别免疫小鼠，并于三免后经口感染旋毛虫肌幼虫，鉴定重组抗原的免疫原性及保护率，结果显示，与PBS对照组相比，rTs-clp、rTs-Adsp、rTs-NBLsp和rTs-serpin免疫组小鼠减虫率分别为：24.42%、41.31%、22.39%、30.5%。重组蛋白免疫小鼠均可诱导体液及细胞免疫应答，表现为特异性IgG抗体升高和混合型Th1/Th2反应，显示为Th1（IFN-γ、IL-2）和Th2（IL-4、IL-10、IL-13）型细胞因子升高，并以Th2型占优势。因此，旋毛虫不同发育时期基因重组蛋白具有较强的免疫原性并可诱导机体产生部分保护性免疫，可用作研制抗旋毛虫病有效疫苗的候选抗原。 最后，优化疫苗的免疫程序（以对旋毛虫肌幼虫产生最低保护作用的rTs-NBLsp为例），为重组蛋白联合疫苗的研制奠定基础。由于弗氏佐剂毒性较强，甚至不适合用作大规模动物实验，本研究对免疫佐剂进行优化，结果显示，铝佐剂可以诱导机体产生与弗氏佐剂相似的免疫反应且毒性较低，因此选用铝佐剂作为联合疫苗的免疫佐剂；使用三种不同抗原剂量（10、20和50μg）免疫小鼠，结果显示20μg重组蛋白免疫组可诱导与50μg免疫组相似的免疫反应，且不改变免疫反应的类型，因此选择20μg作为联合疫苗中每种重组蛋白的免疫剂量。根据上述的疫苗优化程序，将不同发育时期高免疫原性重组蛋白与铝佐剂乳化后联合免疫小鼠（免疫剂量为每种蛋白20μg），结果显示，重组蛋白联合疫苗可诱导机体产生强烈的体液和细胞免疫反应，且每种抗原之间具有协同作用，均诱导机体产生对抗旋毛虫感染有利的免疫反应，使疫苗减虫率提高至70.9%，与单独免疫组相比减虫率大大提高。 综上所述，本研究表明多种重组蛋白联合免疫小鼠在预防旋毛虫病方面可以成为一种十分有前景的方法。本研究结果显示，抗旋毛虫感染有效的疫苗应该由多种寄生虫抗原组成，而且有效的蛋白成分可以在机体中发挥协同作用，诱导宿主产生强烈的保护性免疫反应。