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《吉林大学》 2013年
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抗结核分枝杆菌先导化合物筛选及白花丹素对H37Rv转录组的影响

叶海青  
【摘要】:结核病(Tuberculosis,TB)是世界上分布最广,且对人类健康危害严重的一种古老传染病。在人类历史上,结核病曾经在全球范围广泛流行,已经有数亿人死于结核病。上世纪50年代后,由于有效的抗结核药物的不断发现,结核病的流行得到了有效的控制。但是,近年来,由于广泛耐药菌株的出现和人类免疫缺陷病毒(HIV)的共同作用,致使无论在发展中国家还是发达国家,结核病发病率都有所增加。如何积极防御结核病已经成为摆在人类面前的严峻现实。 数十年来,世界上针对结核分支杆菌开发出了近二十多种药物,但普遍存在的缺点是副作用大,容易产生耐药性。尤其是近些年耐多药及多重耐药菌株(MDR-TB)的出现,使原有的一、二线抗痨药治疗结核病的方案失去了应有的效用,现实对抗结核药物提出了新的挑战。然而,从化学合成物中寻找抗结核药物的难度却日益增大。自2000多年前,中华就有利用传统中草药治疗结核病的记载。近年来国内外将热点集中到从我国丰富的中草药资源中寻找高效的抗结核药物。与中药粗提物或有效组分相比,中药单体化合物具有结构明确,抗菌效果稳定,作用的靶位固定等优点。因此,选择中药单体化合物进行抗结核分支杆菌新药筛选开发,以及对其药物靶标的筛选和确证都具有非常重要的现实意义。 本文通过微量稀释药敏试验方法(MABA)对28种具有潜在抗结核活性的中药单体化合物进行了单一药敏实验和协同药敏实验筛选。根据单一药敏试验,以MIC≦64μg/mL为判断标准,有6种天然植物单体成分表现出较强的抗结核分枝杆菌活性。分别为白屈菜红碱(64μg/mL)、白花丹素(64μg/mL)、齐墩果酸(16μg/mL)、蛇麻酮(32μg/mL)、色胺酮(1μg/mL)和胡桐素A (4μg/mL)。通过联合抗菌试验验证了与一线药物有协同抗结核作用的天然单体化合物四种:白花丹素、白屈菜红碱、蛇麻酮和齐墩果酸。MTT试验结果表明,对Vero细胞,天然单体化合物在高浓度时(≧256μg/mL)具有毒性。 本文应用定制合成的基因芯片检测了白花丹素对M. tuberculosis H37Rv(ATCC27294)转录组的影响。首次从分子层面探讨了白花丹素抗结核分枝杆菌的分子机制。芯片结果表明:以2倍差异表达作为显著性判断标准,在白花丹素的胁迫下,共有274个基因出现差异表达,其中上调表达基因103个,下调表达基因171个。在这些差异表达的基因中25.9%为未知功能基因,已知的功能基因主要包括:假定蛋白类基因(14.6%)、保守的假定蛋白类(16.1%)、新陈代谢相关基因(5.5%)、编码细胞膜的基因(5.1%)、功能调控类基因(4.4%)。推断的可能机制为:①通过上调GroEL/GroES或DnaK/DnaJ的高表达阻止了结核分枝杆菌新合成蛋白质的聚集;②抑制大量的PE和PPE基因,通过此途径降低了结核分枝杆菌的感染力并通过破坏PE和PPE的蛋白比例来降低其活力;③通过抑制结核菌醇二分支菌酸相关基因(DIM)表达,增加结核分枝杆菌外膜的通透性,并在一定程度上导致结核分枝杆菌的的抗性减弱、活性降低;④白花丹素具有天然萘醌的化学结构与结核分枝杆菌的甲基萘醌化学结构相似,MenB表达产物是甲基萘醌生物合成中的关键酶, MenB表达被明显抑制,推测可能是在生物学事件中白花丹素与甲基萘醌发生了竞争性抑制;⑤抑制了一些膜蛋白基因和毒力基因,如膜蛋白基因yrbE4B, yrbE1B,毒力基因mce1;⑥抑制了甘油三酯(TG)合成酶基因,降低了结核分支杆菌的应激力。本文数据为进一步研究白花丹素抗结核分枝杆菌的分子机制奠定了基础。 从芯片筛选的差异表达基因中随机抽取了17个,通过实时荧光定量RT-PCR验证,结果表明,表达谱芯片的结果与RT-PCR结果一致。 本文成功克隆了menB基因和mce1A基因,构建了表达质粒pET-28a-menB和pET-28a-mce1A,并在大肠杆菌中获得了表达的MenB蛋白和Mce1A蛋白。然后用Mce1A蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western-blotting检测了结核分枝杆菌Mce1A蛋白的表达,结果随药物浓度增加,Mce1A蛋白表达量降低。可以推断,白花丹素通过抑制结核分支杆菌Mce1A蛋白表达可减弱病菌进入动物细胞的能力,从而降低了其感染力,间接增强了药物的抗菌能力。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R285

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