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《吉林大学》 2013年
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脑缺血后突触后膜NMDA受体的迁移致神经元死亡及PP2神经保护作用机制的研究

赵景伟  
【摘要】:背景 脑缺血常伴发缺血灶周边的神经元延迟性死亡,其内在的分子机制仍不明确,由NMDA受体介导的兴奋性神经毒性作用是最近的研究重点。最近的研究显示突触后NMDA受体分布于突触膜,突触周膜和胞内,激活这些不同部位的受体群是决定其产生生理性作用还是病理性影响的重要因素。我们先期研究发现,脑缺血再灌注损伤导致突触后关键磷酸化酶Src超激活,突触周膜和胞内NR2A, NR2B亚型向突触膜部位发生迁移聚集。磷酸化信号是调节突触兴奋性和可塑性的重要方式,因此我们假说:脑缺血再灌注损伤激活突触后Src家族酪氨酸激酶,介导突触周膜和胞内NMDA受体向突触膜部位聚集,导致突触膜NMDA在受体数量和亚型构成上发生显著性改变,增加突触后神经元兴奋性从而引起神经毒死亡。 目的:探讨脑缺血再灌注后神经元延迟性死亡的分子机制及PP2神经保护作用的机制。 方法:本实验利用大鼠全脑缺血再灌注模型,大鼠全脑缺血前30分钟脑室内注射药物。按照再灌注时间的不同分为假手术组、PP3治疗对照组和PP2治疗组,再灌注时间分为0.5h、4h和24h。到达再灌注时候后将大鼠脑组织甲醛固定后通过HE染色观察各组间大鼠海马CA1区神经元存活数量。另一部分大鼠在活体麻醉状态下,将脑组织急速液氮冷冻,取出脑组织后在-20℃环境下分离出丘脑背外侧皮层脑组织,利用差速离心来分离各亚细胞组分,通过生化手段来具体分析前脑皮质及各亚细胞组分中Src激酶、NMDA受体及PSD蛋白等的磷酸化状态和分布。 结果: 1.通过病理切片发现,脑缺血再灌注72h时,脑缺血前30min脑室内给予15ug PP2治疗组的大鼠海马CA1区神经元死亡明显少于其对照组; 2.通过Western Blot证实了脑缺血再灌注后突触后膜Src蛋白激酶呈超激活状态。脑组织匀浆后,将匀浆液(HOM)采用差速离心的方法分离突触后膜组分(SYN);突触外膜组分(EXTRA),然后进行Western Blotting分析Src的表达与分布。结果显示:同对照组比较,在SYN组分中,Src-P(Y416)的表达于脑缺血再灌注后0.5h显著增高(p0.01),4h达高峰(p0.01),其后降低;在EXTRA组分中,Src-P(Y416)也是于再灌注后0.5h显著增高(p0.05),其后逐步下降。相反,Src-P(Y527)在SYN中的表达于再灌注后0.5h显著下降(p0.01),直至再灌注后4h,其后升高(p0.01)。由于Y416增强Src活性,Y527抑制Src活性;因此,这些结果提示,脑缺血再灌注后突触后膜Src蛋白激酶呈超激活状态; 3.脑缺血再灌注后,NMDA受体从突触周膜和胞内小泡向突触后膜致密体结构转移聚集。脑组织匀浆后,将匀浆液(HOM)采用差速离心的方法分离突触膜组分(SYN);突触外膜组分(EXTRA),然后进行Western Blotting分析NR2A和NR2B的表达与分布。结果如下图所示:同对照组相比较,缺血再灌注0.5h后,NR2A在EXTRA组分中的表达显著降低(P0.01),直至再灌注后4h(P0.05)和24h(P0.05);在LM组分中在再灌注的各个时间点都呈显著下降(P0.01);与NR2A相似,NR2B的表达和分布也于再灌注0.5h后,在EXTRA中显著降低(P0.01),直至再灌注后24h(P0.01)。不同的是,NR2B于再灌注后4h开始在HOM中的表达显著下调(P0.01),直至再灌注后24h(P0.01);在LM组分中在再灌注的各个时间点都呈显著下降(P0.01)。以上这些结果均提示,脑缺血再灌注后,NMDA受体从突触周膜和胞内小泡向突触后膜转移聚集。 4.通过Western Blot证实了PP2可以下调脑缺血时NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src的磷酸化表达。脑缺血再灌注4小时后,PP3脑室内注射组的Tyr-P表达升高,但是PP2脑室内注射组的Tyr-P较PP3注射组显著下降(p0.01)。相似地,PP3脑室内注射组的PSD93-P(Y340)较对照组显著升高(p0.01),PP2注射后并未能显著抑制其升高。脑缺血再灌注4小时后,脑室内注射PP3及PP2组的NR2B-P (Y1246)较对照组显著增加(p0.05);虽然脑室内注射PP3组的NR2B-P (Y1325)较对照组显著升高(p0.05),但是PP2注射后NR2B-P (Y1325)的表达显著下降(p0.01) 结论: 1.脑缺血再灌注后,突触后膜致密体结构Src蛋白激酶呈超激活、突触后膜NMDA受体群磷酸化水平显著增高 2.脑缺血再灌注后,NMDA受体从突触周膜和胞内小泡向突触后膜致密体结构转移、聚集。 3.PP2通过抑制Src激酶而具有抵抗脑缺血再灌注后神经元延迟性死亡的作用。 总之,通过本实验我们发现,PP2具有抵抗脑缺血再灌注后神经元延迟性死亡的作用,而且脑缺血再灌注后NMDA受体在突触后膜的位置发生迁移,并对其作用机制进行了初步分析,为将来临床使用Src激酶抑制剂治疗缺血性脑病提供了一定的实验和理论基础。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R743.31

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