莱姆病螺旋体脉冲场凝胶电泳标准化技术建立及初步应用研究

【摘要】：研究背景： 脉冲场凝胶电泳PFGE是二十世纪八十年代由Schwartz和Canter发明的，后经一系列发展，最终成为现代分子生物学中一项标准、规范的关键技术。 PFGE近年来被公认为细菌分型及追踪传染源最有效的方法之一，它能够揭示完整的基因组遗传特性。PFGE在细菌的研究中已普遍应用，特别是在疾病的暴发流行中，已经显示出了较强的应用价值。它不仅可单独用于传染病的追踪溯源，而且也可辅助现场流行病调查，用以提供不同菌群间相互关联的证据，现在已经作为传染病暴发中追踪溯源不可缺少的有力工具。此外它还用于传染病动态检测，为预警提供重要参考信息。目前发达国家已建立起国际化病原菌分子分型实验室监测网络（PulseNet），它是以严格的标准化的PFGE操作为基础，通过网络实验室的检测分析和相互间带型的分析比较，建立数据交流的一个网络平台。 莱姆病在全球具有广泛的分布，世界五大洲的七十多个国家已经有莱姆病病例报告。我国是受莱姆病危害十分严重的国家，但目前尚未被列入法定报告传染病。莱姆病的自然疫源地几乎遍布我国所有山林地区，人群中有典型的莱姆病病例存在，我国受莱姆病威胁的人群接近1亿人，估计我国莱姆病的每年新发病例不会少于2万例。目前，绝大部分莱姆病患者得不到明确的诊断和有效的治疗，40%～50%转为中、晚期，长期反复发作，后果严重。 最近，研究发现莱姆病螺旋体的各个基因型与所导致疾病有很强相关性，即不同的基因型可以导致不同的疾病。在这种情况下，需要一种分型能力强、简便、可靠、可以分辨不同莱姆病螺旋体基因型间与型内的分子生物学技术，用于莱姆病螺旋体的预防和控制。 本研究旨在将PFGE技术分型技术引入莱姆病螺旋体，建立莱姆病螺旋体PFGE的标准化操作流程SOP，进一步从染色体DNA角度分析莱姆病螺旋体分类特征，为遗传学分类奠定基础。 目前美国疾病预防控制中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）及亚太地区PulseNet提供的其他病原体PFGE标准化操作程序，结合莱姆病螺旋体菌株的特性，对菌体基因组染色体DNA纯化技术、限制性内切酶消解方案及脉冲场电泳参数进行优化，初步建立莱姆病螺旋体脉冲场凝胶电泳技术，并对国际标准株和我国新疆、内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁、河北、北京、四川、贵州等地菌株共56株进行聚类分析，获得了高清晰度酶切图谱，各株菌都有独特的带型分布，国内菌株与其标准菌株带型相似，都具有优势基因型。不同基因型之间带型完全不同。发现PFGE分型结果与RFLP和MLSA具有高度一致性。 目的： 本研究旨在建立并优化莱姆病螺旋体的脉冲场电泳方法，进一步丰富和完善了莱姆病螺旋体的基因分型研究，为下一步开展莱姆病的预防控制及流行病学调查打下基础。 方法： 利用目前美国CDC及亚太地区PulseNet提供的其他病原体PFGE标准化操作程序，结合莱姆病螺旋体菌株的特性，通过对莱姆病螺旋体基因组染色体DNA纯化，限制性内切酶消解方案及脉冲场电泳参数进行优化，初步建立莱姆病螺旋体脉冲场凝胶电泳技术，并对国际标准株和我国菌株进行聚类分析。 1、BSKII培养基的制备，称量新蛋白胨、HEPES、酵母粉、丙酮酸钠和1066等药品，溶解后调节PH值，加入明胶、牛血清白蛋白Ⅴ和灭活的兔血清，采用硝酸纤维素膜过滤除菌，分装备用； 2、采用BSKII培养基传代培养购买自ATCC的国际标准菌株，并且从国内西北、东北等地区的人血标本、传播媒介蜱和宿主动物鼠的标本中分离培养莱姆病螺旋体活菌，置于33℃恒温箱。置菌夜于暗室野显微镜下观察，待活菌生长繁殖到浓度+++至++++，才能制备胶块，提取染色体DNA； 3、采用胶块包埋法，将菌体包埋于胶块中，裂解细菌，洗胶块，胶块内DNA的酶切，加样，电泳，染色，获取图像，数据分析。选取34株莱姆病螺旋体，选择不同的菌株浓度，不同的内切酶，不同的参数，重复上述实验； 4、对得到的实验图片和数据进行分析，得到最佳的操作方案，最佳的菌株浓度，最佳的内切酶和电泳参数； 5、再选取22株莱姆病螺旋体菌株，采用以上的出的最佳方案，得到聚类图。分析聚类结果，对此实验方法进行评价。 结果： 确立了莱姆病螺旋体PFGE分型方法的标准操作。 结论： 1、PFGE分型方法能较好的反映莱姆病菌株的分子遗传学特征； 2、PFGE、RFLP和MLSA三种分型方法有较好的相关性； 3、PFGE分型方法受外界因素影响较小，可用于日常监测菌株的鉴定分型。 创新点： 将PFGE技术分型技术引入莱姆病螺旋体，建立莱姆病螺旋体PFGE的标准化操作程序，确定莱姆病螺旋体PFGE分型方法的标准操作，进一步从染色体DNA角度分析莱姆病螺旋体分类特征，为遗传学分类奠定基础。在莱姆病的预防和控制工作中，提供标准化数据库。