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姜黄素对喉癌Hep-2细胞的化疗增敏作用及机制研究

张赫佳  
【摘要】:喉癌作为呼吸道第二高发癌,其发病率逐年上升。目前,喉鳞状细胞癌的主要治疗手段大体上可分为手术、放疗、化疗三大类,化疗作为喉鳞状细胞癌及其他头颈癌的主要治疗手段,往往存在化疗不敏感、化疗抵抗以及化疗后易复发等。因此,增强喉癌化疗敏感性,降低化疗的抵抗作用,就成为了广大学者争相追逐的研究热点之一。 诸多学者研究发现,化疗时喉癌细胞易产生多药耐药,使得肿瘤对化疗药物敏感性降低、抵抗作用增强。人们还发现了另一种可以解释肿瘤化疗不敏感的思路--“肿瘤干细胞理论”:肿瘤对化疗产生抵抗可能是通过肿瘤干细胞实现的,化疗可以杀灭大多数肿瘤细胞,对肿瘤干细胞却没有作用,肿瘤干细胞经过增殖,最终又可导致肿瘤复发。因此,提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性、逆转干肿瘤细胞的化疗抵抗,已成为当前提高肿瘤化疗效果的关键所在。 姜黄素(curcumin)是一种黄色结晶粉末状植物多酚,源自姜黄(Curcuma longa Linn)根茎,姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗凝、抗肿瘤、抗突变等作用,尤其对CSC有特异的抑制作用。先前的研究证实,姜黄素对前列腺癌细胞、人鼻咽癌细胞、胃腺癌细胞、人结肠癌细胞及人肝癌细胞等有明显抑制作用,对喉癌细胞的作用却鲜有报道,另外,此类作用的相关机制也不十分清楚。因此,我们的研究将探讨姜黄素对喉癌细胞生物学行为的影响,探讨姜黄素和顺铂对喉癌细胞的“抗肿瘤”作用,分析姜黄素增强喉癌细胞化疗敏感性的作用机制。为姜黄素在喉癌化疗中的应用提供理论基础,同时也为姜黄素对肿瘤干细胞的特异性杀伤作用提供理论支持,为最终提高临床喉癌的化疗效果寻找新的途径。 研究方法: 为了探讨姜黄素对喉癌的增敏作用,我们的实验分为体外、体内两部分,采取以下实验方法: 体外实验部分: 1.集落形成实验、MTT实验--姜黄素联合顺铂对喉癌Hep-2细胞增殖的影响 2.Annexin-V/PI双标实验--姜黄素联合顺铂对喉癌Hep-2细胞凋亡的影响 3.细胞划痕实验--姜黄素联合顺铂对喉癌Hep-2细胞体外迁移能力的影响 4.流式细胞仪检测和流式细胞仪CD133+细胞分选实验--姜黄素与顺铂对Hep-2细胞中CD133+细胞群的影响 5.Western-blot实验--姜黄对CD133+细胞中ABCG2的表达的影响 体内实验部分: 1.肿瘤生长测定 2.肿瘤终末体积测量 3. Tunel法--姜黄素和顺铂对肿瘤细胞凋亡的作用 4. western-blot法--检测肿瘤凋亡相关蛋白的表达 结果: 体外实验部分: 1.集落形成实验表明,联合应用顺铂和姜黄素可以减少Hep-2细胞的增殖,抑制集落形成,未处理组克隆集落(大于100个细胞)数为526±35个,姜黄素组和顺铂组形成的集落数都减少,而姜黄素联合顺铂组的集落数明显减少到150±40个,而且集落的大小也明显变小, P0.05,差异具有统计学意义;单纯姜黄素和姜黄素脂质体组则无明显差异,由此也证实脂质体可作为姜黄素的载体,而对喉癌Hep-2细胞不起到明显生物学作用。 2. MTT实验进一步证实联合应用姜黄素和顺铂可显著抑制Hep-2细胞的增殖,单独应用顺铂,增殖能力减少约60%,而在姜黄素联合顺铂给药组,增殖能力减少约90%,P0.05,差异具有统计学意义。同样,该实验也证明了脂质体可以作为安全的载体,对Hep-2细胞没有作用。 3. Annexin V/PE双标法实验证实,姜黄素和顺铂分别单独对Hep-2细胞作用48小时,都可以促进Hep-2细胞的凋亡,当姜黄素与顺铂联合应用时,这种促进凋亡的作用就更加显著。未处理组Hep-2细胞凋亡百分比为2.35±1.6%,姜黄素和顺铂单独处理组Hep-2细胞凋亡百分比增加到13.4±2.8%和32.1±9.5%,而姜黄素+顺铂联合给药组Hep-2细胞凋亡百分比则明显上升,为54.4±11.8%。 4.划痕实验检测姜黄素和顺铂对喉癌Hep-2细胞体外迁移能力的影响:姜黄素组、顺铂组及姜黄素+顺铂组的Hep-2细胞较空白对照组细胞迁移距离缩短,并且联合给药组Hep-2细胞迁移距离缩短更加明显,这说明姜黄素联合顺铂对喉癌Hep-2细胞体外迁移能力有明显的抑制作用。 5.流式细胞仪检测和流式细胞仪CD133+细胞分选实验检测:未处理组Hep-2细胞中,CD133+细胞群平均检出率为4.5±1.2%,顺铂组Hep-2细胞中,CD133+细胞群检出率为6.89±1.1%,但顺铂联合姜黄素联合给药组Hep-2细胞中,CD133+细胞群检出率明显减少,为1.49±1.0%。顺铂组相较顺铂+姜黄素联合给药组的峰值曲线有明显的左移,这个结果表明,化疗药顺铂可以使CD133+富集,而当顺铂联合姜黄素应用时,这种富集作用被明显的抑制了。 6.利用western blot法检测ABCG2蛋白表达,在CD133+细胞群中,ABCG2在未处理组CD133+中高表达,在姜黄素+顺铂联合给药组低表达;在CD133-细胞群中,ABCG2也呈低表达,β-action作为对照。可见,分组处理后,CD133+和CD133-细胞被收集并检测ABCG2蛋白表达,未处理组和顺铂处理组CD133+细胞中ABCG2表达没有明显差异,而在姜黄素+顺铂联合给药组,CD133+细胞中的ABCG2的表达与未处理组CD133-细胞中ABCG2的表达一样,为低表达。 体内实验部分: 1.肿瘤生长曲线图结果显示:从给药后第6天开始,姜黄素+顺铂组的瘤体积开始小于对照组(P=0.014),从给药后第9天开始,姜黄素+顺铂组的肿瘤体积开始小于单纯姜黄素组(P=0.026),而从给药后第12天开始,姜黄素+顺铂组的肿瘤体积开始小于顺铂组(P=0.043),并且这种差异随着给药时间的延长增加,对照组的肿瘤体积与姜黄素组比较则无显著差异。以上结果提示提示姜黄素显著提高了喉癌的的化疗敏感性。 2.肿瘤终末体积测量结果:顺铂+姜黄素组和顺铂组的肿瘤体积相较空白对照组、姜黄素组有所减小,顺铂+姜黄素组肿瘤终末体积减小的更加明显。 3. Tunel染色实验检测肿瘤细胞的凋亡情况,结果显示:在空白对照组和姜黄素组,Tunel染色阳性细胞的比例分别为24.4±6.2%和25.2±8.8%,没有明显的差异;在顺铂组中,Tunel染色阳性细胞的比例为38.6±7.2%,而在姜黄素+顺铂组,染色阳性细胞的比例为59.6±6.9%,Tunel染色阳性细胞的比例,较顺铂组显著提高,这说明姜黄素有效的提高了喉癌化疗后的凋亡发生。这一结果与体外实验所得结果相一致。 4.利用western blot实验检测凋亡相关性蛋白caspase-3的表达水平:在空白对照组和姜黄素组中,caspase-3蛋白的表达水平无显著差异;在化疗组,casepase-3的表达增加,而在姜黄素+顺铂组的表达则显著高于其他三组(P<0.05),与Tunel染色结果相一致,这进一步肯定姜黄素确实增加了化疗癌组织的凋亡发生。 结论: 1、联合应用姜黄素可提高喉癌Hep-2细胞的化疗敏感性。 2、喉癌Hep-2细胞中存在的少量CD133+细胞具有化疗抵抗性,姜黄素抑制顺铂对Hep-2细胞中CD133+肿瘤干细胞的富集,并通过降低ABCG2蛋白的表达,逆转喉癌Hep-2细胞中CD133+细胞的化疗抵抗。


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