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绿脓杆菌比色LAMP检测法的建立及水貂出血性肺炎绿脓杆菌三价灭活疫苗的研制

韩明明  
【摘要】:水貂出血性肺炎(Mink hemorrhagic pneumonia)是由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,又称绿脓杆菌)引起水貂的一种急性、接触性传染病,以出血性肺炎和败血症为主要特征。该病发病急、病程快,给水貂养殖业带来了巨大的经济损失。该病呈现地方流行性,因此对我国局部地区进行水貂出血性肺炎流行病学调查对该病的防治非常重要。绿脓杆菌对多种抗生素耐药、其内毒素蛋白质(OPE)与多种病原存在交叉反应,且我国尚未有对水貂出血性肺炎的国家认证疫苗,为水貂绿脓杆菌的预防、治疗以及诊断带来了困难。为了防治水貂出血性肺炎,本研究对山东地区水貂出血性肺炎进行了流行病学调查,选择该地区流行血清型以及ERIC-PCR分子型菌株制备了三价灭活疫苗,并依据绿脓杆菌ExotoxinA(ETA)基因建立了快速检测水貂出血性肺炎的比色环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplifcation; LAMP)法。 首先,本研究对山东地区2011-2012年水貂出血性肺炎病例进行病原分离,通过生化方法、PCR对病原进行了鉴定;结果显示,检出绿脓杆菌引起的出血性肺炎为90例,占总病例68.18%。运用日本生研株氏绿脓菌群分型血清对分离株进行了血清分型;结果显示,血清G型为主要流行型,占55.6%;血清C型与I型为次要流行型,分别占20%、18.9%。通过ERIC-PCR方法对分离株进行了分子分型;结果显示,该地区基因型存在多样性,ERIC-PCR分子型18型、39型为主要流行型;同时对分离株进行了抗生素药物敏感性分析,结果显示大多数分离菌株对恩诺沙星敏感。 随后,本研究根据绿脓杆菌保守基因—ETA基因设计三对引物,包括有1对外引子F3/B3、1对内引子FIP/BIP、1对环状引子LF/LB,在反应体系中加入羟基萘酚蓝(Hydroxy naphthol blue,HNB),建立了检测绿脓杆菌的比色LAMP法。经过对反应条件的优化,结果显示最佳的反应时间为30min,最佳的反应温度为65℃;对该方法进行了敏感性、特异性分析,结果显示,该方法敏感性是PCR方法的10倍,与大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌以及克雷伯菌无交叉反应;用LAMP比色法对90株分离株进行检测,检出率为100%;对24例水貂出血性肺炎病料检测,阳性率为95.8%,表明本方法可以用于水貂出血性肺炎的快速诊断。 根据该地区流行病学调查结果,筛选出连续传代对绿脓杆菌毒力、菌含量与免疫原性稳定的分离株血清G型SD312、血清C型SD302、血清I型SD403,作为疫苗候选株用于制备预防水貂出血性肺炎的三价灭活疫苗;通过对菌株培养条件的优化,制备了三批次水貂出血性肺炎三价灭活疫苗;经无菌检验、甲醛及含汞量检验、安全性检验,三批次灭活疫苗质量安全,可以用于后续免疫效果评价。 随后测定了研制的三价灭活疫苗对小白鼠、水貂的免疫效果评价。结果显示,对水貂的最小免疫剂量(MID)为0.25mL,免疫剂量为1mL;在免疫疫苗21~28d后,血清抗体水平达到峰值,在42d抗体水平出现下降;小鼠免疫疫苗后,体重无明显差异(P0.05);疫苗的免疫保护期为180d;疫苗在2~8℃条件下保存8月内对免疫效果无明显影响。临床试验结果显示,免疫后水貂发病率为0.0005%,显著低于未免疫的0.17%,表明该疫苗对预防山东地区水貂出血性肺炎具有显著效果。 本研究对山东水貂出血性肺炎流行情况进行了调查,建立快速检测水貂出血性肺炎病原绿脓杆菌的比色LAMP法,研制了预防水貂出血性肺炎的三价灭活疫苗,为水貂出血性肺炎的诊断及该病的防治奠定了理论依据与实践基础。


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