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以秀丽隐杆线虫为模型的铃兰毒甙抗衰老研究

郭佑铭  
【摘要】:衰老是随着年龄增长生物体内的各个组织器官从细胞水平开始的程序性衰退过程,是生物体内普遍存在的现象。机体的衰老通常伴随着老年性疾病如白内障、心脏病等的发生。同时衰老也受到众多转录因子和其他抗衰老、抗氧化基因的调控。随着衰老相关信号通路和分子机制研究的不断深入,越来越多作用于特定靶点和信号通路的药物也逐渐被开发出来。 目前抗衰老的主要药物包括天然药物与化学合成药物。天然药物作为回归自然受益自身的药物,已成为筛选抗衰老药物的主要来源,被广泛应用。天然药物包括植物药、动物药、微生物药等。其中植物药的开发应用以其治疗上的独特优势、毒副作用小、在衰老等疑难杂症上有广阔的应用前景而占据主导地位。本论文选用的植物药是来自于铃兰的铃兰毒甙。本实验室前期工作发现铃兰毒甙有显著提高sirt1基因表达和抗细胞氧化损伤的作用。鉴于SIRT1蛋白高表达会延缓衰老,降低与年龄相关的慢性疾病的发生频率。为进一步确定铃兰的抗衰老作用,我们拟利用线虫研究铃兰毒甙的抗衰老作用及相关机制。 本论文以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans, C. elegans)为模型动物测定铃兰毒甙给药前后线虫的寿命变化、抗热激、抗氧化损伤能力。在此主要考察了sir-2.1介导的热量限制途径和daf-16参与的胰岛素/胰岛素样生长因子II信号通路,通过荧光显微镜、Real-Time PCR等方法进一步研究铃兰毒甙抗衰老的相关分子机制。 首先本论文考察铃兰毒甙对线虫的寿命影响。对N2野生型线虫,20μM铃兰毒甙给药组能提高线虫平均寿命16.3%,超过阳性对照组白藜芦醇。2μM铃兰毒甙使平均寿命延长1.48%,而高浓度200μM铃兰毒甙反而缩短了寿命周期。说明寿命延长不是药物浓度依赖型,类似于毒物刺激效应;对于sir2.1缺失突变体线虫,20μM给药后线虫寿命依旧延长,而对daf-16缺失突变体和daf-2、daf-16双缺失突变体线虫给药后,抗衰老作用消失,这说明铃兰毒甙引发的寿命延长作用依赖于daf-16。 其次考察了在热激状态下,铃兰毒甙对野生型线虫和突变体线虫的影响。根据存活率结果,20μM铃兰毒甙增强野生型线虫和sir-2.1缺失的VC199线虫的热抵抗能力,相应的热损伤产生的ROS都有减低,而对daf-16缺失突变体无热保护作用,说明铃兰毒甙诱导的抗热激能力与daf-16有关,并且我们考察了daf-16调控的下游基因sod-3和hsp16.1,铃兰毒甙诱导的热激耐受增强了这两个基因的表达,这再次说明铃兰毒甙诱导线虫的抗热激能力的提高是作用在DAF-16/FOXO通路上的。 再次,氧化胁迫造成外源性自由基的累积,是促进衰老的主要方式。因此本论文在氧化应激条件下考察了线虫的存活率并利用突变体检测与哪些基因有关。实验发现20μM铃兰毒甙对线虫的抗氧化保护能力依赖于daf-16和sir-2.1,并且在氧化损伤下检测到铃兰毒甙给药刺激了ctl-2、sod-3等daf-16下游基因转录上调;利用TJ356线虫追踪不同浓度铃兰毒甙对DAF-16入核状态的影响,结果发现,20μM铃兰毒甙最能刺激DAF-16核转位,核转位与药物浓度没有正相关性,根据铃兰毒甙对野生型线虫寿命的影响结果和线虫体内ROS含量在氧化损伤后的变化结果,我们推测这可能是药物的毒物刺激导致的抗衰老抗损伤等效果。随后我们用SOD-3::GFP共表达的线虫来进一步确认DAF-16的转录活性对提高线虫抗氧化损伤能力的必要性。最后本论文认为20μM铃兰毒甙以毒物刺激方式激活daf-16/FOXO信号通路及其下游基因,从而达到延缓线虫衰老的作用。 综上所述,本论文通过秀丽隐杆线虫确定了铃兰毒甙抗衰老作用及其作用特点,初步解释了铃兰毒甙延缓线虫衰老的分子机制。其机制为抑制胰岛素信号通路,以daf-16为靶标,激活其转录活性并促进下游抗氧化抗热激基因的表达来达到抗衰老的功效。为进一步确定其直接作用位点和信号通路,阐述铃兰毒甙参与机体降低ROS延迟衰老的深入细致的作用机理提供了实验依据。


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1 郭佑铭;以秀丽隐杆线虫为模型的铃兰毒甙抗衰老研究[D];吉林大学;2014年
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