兔脂肪干细胞与软骨细胞体外共培养最适诱导配比的研究

【摘要】：实验目的：建立软骨细胞（ACs）和脂肪干细胞(ADSCs)间接共培养体系，通过定量分析诱导后ADSCs成软骨分化相关基因（Col2a1，ACAN, Sox-9）及老化相关基因(Col10a1，Runx-2)的表达水平，研究该体系中两类细胞的比例变化对诱导结果的影响，进而探究软骨组织工程中共培养模式的诱导机制，从而为今后构建组织工程软骨的方法改进提供线索； 实验方法：本实验采用间接共培养模式，在Transwell孔板中依据ACs-ADSCs构成比的逐级增加设置6个共培养实验组，即组A（0.5：1），组B（1：1），组C（2：1），组D（3：1），组E（5：1），组F（7：1）；另设3个对照组，即ADSCs阴性对照组、 ADSCs生长因子（TGFβ+BMP6）诱导对照组以及ACs阳性对照组。除ADSCs生长因子诱导对照组外，其余各组均在不含生长因子及血清的不完全软骨诱导液中进行诱导，培养周期为28天。培养结束后收集ADSCs微球进行时定量RT-PCR检测，分析诱导后ADSCs成软骨分化相关基因（Col2a1，ACAN, Sox-9）及老化相关基因(Col10a1，Runx-2)的表达情况； 实验结果：共培养各组的Col2a1和ACAN基因表达水平均出现不同程度的上调，且在ACs-ADSCs比到达5：1之前，有随体系中ACs比例增加而上调的趋势。Col2a1在组E（5：1）和组F（7：1）中的表达水平显著高于其余共培养组（P0.01），而E，F两组间无统计学差异；ACAN在组E（5：1）中的表达水平达到最高，且显著高于组F（7：1）和组D（3：1），P0.05；与Col2a1和ACAN不同，Sox-9在各个共培养组均有和缓上调且在组D（3：1）中显著高于阴性对照组（P0.05）。另外值得注意的是，与生长因子诱导组不同，共培养各组成软骨相关基因的阳性表达并没有伴随老化相关基因的显著表达。具体来讲，Col10a1在共培养各组中的表达水平仅存在轻微上调且与基线水平无统计学差异，而在生长因子诱导组中该基因的表达水平则显著高于基线水平（P0.001）,达到组C的85倍；与Col10a1相似，Runx-2在生长因子诱导组中的表达高于所有共培养组，且与共培养组A,B,C及E存在统计学差异（P0.01）； 结论：间接共培养可以在不添加外源性生长因子的条件下，通过细胞分泌可溶性因子的形式将ADSCs向软骨组织诱导，与此同时显著抑制老化相关标志物的表达。然而，为了获得这种较为理想的诱导结果，该体系所需的ACs比例较同条件下直接共培养体系高，所以我们认为在共培养体系中，释放于诱导环境中的可溶性因子虽然发挥诱导作用，但却不能取代直接共培养体系中细胞-细胞以及细胞-ECM间的相互作用。

【关键词】：兔脂肪干细胞 软骨细胞 组织工程软骨 间接共培养
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329
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