长白山高山红景天保护遗传学研究

【摘要】：本文主要从保护遗传学角度出发，以高山红景天不同地理居群（3个自然居群和一个迁地保护居群）为研究对象，研究了海拔梯度所引起的环境差异对高山红景天遗传特性和中药指纹变化的影响。一方面采用RAPD和ISSR分子标记技术分析了高山红景天不同地理居群的遗传多样性和遗传结构；另一方面采用MSAP分子标记分析了高山红景天不同地理居群的DNA甲基化模式和表观遗传变异；最后，应用HPLC色谱指纹研究了高山红景天中药指纹变化，并分析了海拔、遗传结构、表观遗传结构以及中药指纹之间的相互关系。主要结论如下： （1）采用RAPD和ISSR分子标记技术分析了高山红景天4个不同地理居群的遗传多样性和遗传结构。7个RAPD引物共扩增得到177个位点，多态性位点百分率（PPL）为94.92%，Shannon’s信息指数（I）为0.5013；12条ISSR引物共扩增得到349个位点，多态性位点百分率（PPL）为97.71%，Shannon’s信息指数（I）为0.4299。两种分子标记方法均揭示了不同地理居群的高山红景天都具有较高的遗传多样性，与自然居群相比较，迁地保护居群（ESP）具有更高的遗传多样性。 Nei's遗传结构分析表明不同地理居群的高山红景天具有明显的遗传分化（Gst，0.4784RAPD和0.3490ISSR）；分子变异（AMOVA）分析结果进一步表明居群间的遗传分化占有重要的地位（55.61%RAPD和45.12％ISSR）。 基于遗传分化系数Gst计算得到的基因流分别为0.5451（RAPD）和0.9327（ISSR），表明高山红景天居群之间缺乏基因交流，这可能是引起居群间具有明显遗传分化的原因之一。 通过遗传距离的UPGMA聚类分析结果显示，来自同一居群的高山红景天个体各自聚为一支。迁地保护居群（ESP）与位于海拔2000米的自然居群（TZ3）总是聚为一支，主坐标分析结果显示这两个居群间有少量个体重叠，说明高山红景天迁地保护居群主要来自海拔2000米的自然居群。 （2）采用MSAP分子标记分析高山红景天不同地理居群的DNA甲基化水平和表观遗传结构，揭示了高山红景天在海拔梯度下的表观遗传变异。实验结果显示，位于高海拔的自然居群具有较高的DNA甲基化水平，而位于低海拔的迁地保护居群具有相对较低的甲基化水平。表观遗传结构分析结果显示，4个高山红景天居群具有较为显著的DNA甲基化多态性，多态性位点百分率为（PPL）85.99%，Shannon’s信息指数（I）为0.3778。 DNA的甲基化模式在高山红景天不同地理居群之间具有特异性，不同地理居群的高山红景天具有明显的表观遗传分化，遗传分化系数Gst为0.5892。AMOVA分析结果表明高山红景天的表观遗传分化主要存在于居群间，为63.87%。 表观遗传距离的UPGMA聚类分析结果与RAPD和ISSR聚类结果相似，位于同一海拔的高山红景天个体各自聚为一支。迁地保护居群ESP与自然居群TZ3也聚为一支，主坐标分析结果显示自然居群TZ3与迁地保护居群ESP有少部分重叠，说明这两个居群之间具有极近的表观遗传关系。 （3）采用HPLC指纹技术分析了高山红景天不同地理居群的中药指纹图谱。分析结果显示高山红景天迁地保护居群的主要药用成份红景天苷含量明显低于自然居群，其药用价值已经降低。 中药指纹相似度分析结果表明迁地保护居群与自然居群具有显著的中药指纹差异。中药指纹相似性的聚类分析显示，ESP单独聚为一支，说明高山红景天迁地保护居群不仅发生了主要药用成份的变化，而且整个次生代谢产物组成也发生了一定程度的改变。 （4）相关性分析结果揭示了海拔、遗传结构、表观遗传结构以及中药指纹模式之间存在紧密联系。海拔梯度引起的环境因子差异是除繁殖策略外，导致高山红景天不同地理居群存在明显差异的主要原因。