葫芦素B磷脂/胆盐混合纳米胶束口腔速溶膜给药系统的构建与评价研究

【摘要】：水溶性差、生物利用度低等问题限制了难溶性药物的应用，磷脂/胆盐混合纳米胶束(phospholipid/bile salt mixed micelles, PL/BS-MMs)作为新型纳米给药系统，为改善药物的溶解度和生物利用度提供了有效的途径。然而，PL/BS-MMs为液体制剂，稳定性相对较差，且不易储存、运输与携带，这在一定程度上制约了PL/BS-MMs的应用与推广。口腔速溶膜（Orodispersible films,ODFs）作为一种相对较新的口服固体速释制剂，因其易于吞咽、释药快速等特点受到越来越多的关注。然而，难溶性药物口服吸收差，生物利用度低等问题限制了ODFs在难溶性药物中的开发与应用。 为了提高难溶性有效成分的溶解度及其生物利用度，同时为了实现PL/BS-MMs的固体化，本文结合PL/BS-MMs与ODFs两种给药系统的优势，制备新型的磷脂/胆盐混合纳米胶束口腔速溶膜给药系统（the ODFs containingPL/BS-MMs，PL/BS-MMs-ODFs），实现PL/BS-MMs的固体化，同时解决ODFs不适合递送难溶性药物的问题。本文以葫芦素B（cucurbitacin B，Cu B）为模型药进行系统研究。 本文采用高效液相色谱法用于Cu B的含量测定，考察药物与辅料相容性实验结果表明磷脂、胆盐、普鲁兰多糖、PEG400、L-HPC以及阿司帕坦均可以用于Cu B的制剂研究。药物在溶媒中溶解度的测定表明Cu B疏水性较强。 采用薄膜分散法制备了Cu B-PL/BS-MMs，通过单因素考察实验，优化了处方中磷脂与胆盐的质量比、磷脂与胆盐的总量以及Cu B的加入量，确定了CuB-PL/BS-MMs的最佳制备工艺为：称取磷脂3g，加入无水乙醇使其溶解，将磷脂的无水乙醇溶液置于旋转蒸发仪中以挥去有机溶剂得到脂膜，称取脱氧胆酸钠2.4g，用100mL蒸馏水溶解后，得到脱氧胆酸钠的水溶液，将脂膜与脱氧胆酸钠溶液在45℃水浴中超声混合得澄清透明的磷脂/胆盐混合空白胶束溶液，称取Cu B0.5g，加入空白胶束溶液中，充氮密封，置恒温磁力搅拌器上，均匀搅拌24h后，即得到Cu B-PL/BS-MMs。采用最佳制备工艺制备的Cu B-PL/BS-MMs包封率可达97.68%，粒径为（86.21±6.11） nm，PI值为0.146±0.004，ζ-电位为（-31.21±1.17）mV，采用透射电子显微镜检测所得胶束的形态和粒径，结果显示混合纳米胶束的粒径大小与激光粒度分析仪所测定的范围相符，且混合纳米胶束形态为球形。初步稳定性考察实验结果表明Cu B-PL/BS-MMs在72h内的粒径和包封率均无明显变化，是一个稳定的胶态系统。采用芘荧光探针法结合Origin软件拟合曲线，测定了Cu B-PL/BS-MMs的CMC为0.047g/L，预示了混合纳米胶束在进入体循环后可能具有良好的抗稀释作用，稳定性较好。 为结合PL/BS-MMs与ODFs两种给药系统的优势，采用溶剂浇铸法制备了新型的Cu B-PL/BS-MMs-ODFs。通过Box-Behnken设计-效应面法优化处方，最终确定Cu B-PL/BS-MMs-ODFs的制备工艺为：取Cu B-PL/BS-MMs10mL，将普鲁兰多糖（53mg/mL）、PEG400（40mg/mL）、阿司帕坦（0.5mg/mL）分别加入其中，持续搅拌，混合均匀，静置45min脱气，然后将其浇铸于玻璃板上，室温干燥24h，切割成2cm×2cm的膜片，包装即得。对Cu B-PL/BS-MMs-ODFs的各项制剂学性质进行考察研究：从SEM照片中可以看到所得膜剂致密无裂痕，且纳米粒均匀分散于Cu B-PL/BS-MMs-ODFs原膜的中间及边缘各部分，显示了良好的均一性；力学参数的测定结果表明Cu B-PL/BS-MMs-ODFs的弹性模量、断裂伸长率、抗张强度均在膜剂可接受范围之内；经检测Cu B-PL/BS-MMs-ODFs的崩解时限为31s，在1min以内，符合口腔速溶制剂的要求；对CuB-PL/BS-MMs-ODFs进行了复溶，测定了其复溶后的粒径、包封率，同时采用透射电子显微镜（TEM）鉴定了其表面形态，并将所得各参数结果与原始的CuB-PL/BS-MMs各参数结果进行了对比，结果表明，复溶后的CuB-PL/BS-MMs-ODFs基本维持了Cu B-PL/BS-MMs的各项特征，揭示了具有良好再分散性的Cu B-PL/BS-MMs-ODFs被成功制备了。 采用大鼠在体肠循环法研究Cu B-PL/BS-MMs-ODFs的口服吸收动力学特征，并以Cu B-PM和Cu B-Bulk为参比制剂，从药物浓度-时间曲线及吸收参数综合分析可得出，Cu B-PL/BS-MMs-ODFs组的吸收速率明显优于Cu B-PM及Cu B-Bulk组，其吸收速率常数（Ka）较Cu B-PM及Cu B-Bulk药分别提高了3.57倍和4.27倍，吸收半衰期（t1/2）也随之减少。结果表明，Cu B制备成PL/BS-MMs-ODFs后，可显著提高药物的体内吸收（p0.05）。 对Cu B-PL/BS-MMs-ODFs大鼠体内药代动力学进行了初步研究，结果表明，与Cu B原料药相比，Cu B-PL/BS-MMs和Cu B-PL/BS-MMs-ODFs的Cmax和AUC(0-t)均明显增加（P0.05），而Tmax明显减小（P0.05）。分别计算CuB-PL/BS-MMs和Cu B-PL/BS-MMs-ODFs相对于Cu B原料药的相对生物利用度，结果分别为2.47倍和2.63倍。Cu B-PL/BS-MMs与Cu B-PL/BS-MMs-ODFs的药代动力学参数没有明显差异。 对Cu B-PL/BS-MMs-ODFs的大鼠体内分布进行了初步研究。建立了Cu B在组织匀浆中的HPLC测定方法，结果表明，将Cu B承载于PL/BS-MMs-ODFs后能够显著提高其在肝脏和脾脏中的靶向性。 采用MTT比色法研究了不同浓度的Cu B-PL/BS-MMs-ODFs以及Cu B混悬液对人肝癌HepG-2细胞的细胞毒作用，结果表明，Cu B-PL/BS-MMs-ODFs和Cu B混悬液对HepG-2细胞抗肿瘤活性均具有剂量和时间依赖性，且CuB-PL/BS-MMs-ODFs的抗肿瘤活性要明显高于Cu B混悬液。 综上所述，将难溶性成分Cu B制备成Cu B-PL/BS-MMs-ODFs后，其生物利用度、体内靶向性以及体外抗肿瘤活性都得到了显著改善。因此，将PL/BS-MMs与ODFs有机结合，制备新型的PL/BS-MMs-ODFs给药系统，是提高难溶性有效成分口服生物利用度的有效方法，同时也为PL/BS-MMs的固体化提供了一个成本低廉、简单易行的方法。