五味子化学成分的研究

【摘要】：五味子（Schisandrae chinensis Fructus）为木兰科植物五味子[Schisandraechinensis(Turcz.)Baill.]的干燥成熟果实，习称“北五味子”，民间药用历史悠久，常用于治疗久咳虚喘、久泻不止、盗汗、津伤口渴、短气脉虚、心悸失眠等症。 五味子中含有多种化学成分，主要有木脂素、三萜、黄酮、挥发油、多糖、有机酸等。 本实验将北五味子用70%乙醇回流提取，经大孔吸附树脂、硅胶和ODS柱层析分离以及重结晶等方法，得到10个单体化合物。利用现代波谱学、薄层色谱与标准品对照等手段并结合其理化性质，鉴定了它们的化合物结构。本实验首次建立了五味子中-cubebenate含量的HPLC测定方法。此外，还对南、北五味子提取物、木脂素类单体混合物的催眠活性进行了研究。 一、五味子的提取、分离和结构鉴定 1.1提取 将30kg五味子用70%乙醇回流提取三次（料液比分别为10:1、8:1、8:1，V/W），回流时间分别为1.5h、1.0h、1.0h,合并三次提取液，过滤，浓缩后用水稀释，过D-4020大孔吸附树脂柱，70%乙醇洗脱，浓缩，干燥得粗提取物1.8kg。 1.2分离与纯化 将上述1.8kg粗提取物进行硅胶柱层析分离，收集洗脱液，合并相同组分，蒸干溶剂，得到三个部分。 （1）将第一部分进行硅胶柱层析，分离得到A、B、C、D共4个部分。 （2） A部分经硅胶、ODS柱层析，分离得到化合物wwz-1。 （3） D部分经硅胶柱层析分离，得到D1和D2两个部分。将D1部分进行硅胶柱层析分离，得到d1、d2、d3、d4、d5共5个部分。再分别进行ODS柱层析，从d1部分中分离得到化合物wwz-2和wwz-4，从d2部分中分离得到化合物wwz-3，从d3部分中分离得到化合物wwz-5，从d4部分中分离得到化合物wwz-6和wwz-8，将d5部分中分离得到化合物wwz-9。D2部分经重结晶得到化合物wwz-10。 （4）将第二部分进行硅胶柱层析分离，得到E、F两个部分。将E部分进行重结晶，得到化合物wwz-7。 1.3结构鉴定 利用波谱学数据分析等方法，鉴定了分得的10个化合物的结构，它们分别是-cubebenate (wwz-1)、（-）戈米辛K1（wwz-2）、β-花柏烯酸(wwz-3)、戈米辛E(wwz-4)、戈米辛J（wwz-5）、当归戈米辛p(wwz-6)、五味子醇甲（wwz-7）、五味子醇乙（wwz-8）、五味子甲素（wwz-9）和五味子乙素（wwz-10）。 二、HPLC法测定北五味子中α-cubebenate的含量 1、仪器、色谱条件 色谱仪：Agilent1100HPLC 色谱柱：Agilent Extend-C18(250mm×4.6mm，5μm） 色谱条件：流动相：乙腈-水（76:24）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；波长：220nm；进样量：20μL。 2、方法学考察 2.1线性关系 在进样质量为0.0068~4.12μg的范围内，化合物-cubebenate的进样质量与峰面积呈现良好的线性关系，其线性方程为y=10807x+15.059，r=0.9997。 2.2检测限和定量限 化合物-cubebenate检测限为8.24×10-3μg，定量限为3.80×10-2μg。 2.3精密度 化合物-cubebenate的日内和日间峰面积的RSD值分别为1.72%和1.51%，表明精密度良好。 2.4重复性 五味子中化合物-cubebenate含量的RSD值为1.48%，表明重复性良好。 2.5稳定性 供试品溶液在0～12h内每隔2h测定一次，化合物-cubebenate峰面积的RSD值为1.07%，表明稳定性良好。 2.6加样回收率 化合物-cubebenate的平均加样回收率为98.2%，其RSD值为1.73%，表明回收率良好。 2.7含量测定 黑龙江、辽宁、吉林三个产地五味子样品中，化合物-cubebenate的平均含量分别为0.594mg·g-1、0.545mg·g-1和0.718mg·g-1。 三、南、北五味子提取物及木脂素类单体混合物催眠活性研究 3.1样品制备及含量测定 本论文分别制备了北五味子提取物和南五味子提取物，并测定了其中主要木脂素类成分的含量。北五味子提取物中五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素的含量分别为43.28mg·g-1、5.89mg·g-1、21.90mg·g-1、20.46mg·g-1、29.04mg·g-1和27.51mg·g-1，南五味子提取物中五味子酯甲、五味子甲素的含量分别为18.61mg·g-1、39.19mg·g-1，其它化合物未检测到。 3.2催眠活性研究 通过小鼠直接催眠实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验、戊巴比妥钠阈剂量催眠实验及巴比妥钠睡眠潜伏期实验，观察了两种五味子提取物及按照北五味子提取物中的含量比例配制的木脂素类单体混合物的催眠活性。结果表明，南、北五味子提取物以及木脂素类单体混合物均对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量和阈剂量催眠具有明显协同作用，可显著缩短巴比妥钠小鼠睡眠潜伏期，并延长睡眠时间。 四、总结 本文对五味子的化学成分进行了研究，共分离鉴定了10个单体化合物，同时首次建立了五味子中-cubebenate的HPLC含量测定方法。此外，对北五味子提取物、南五味子提取物以及木脂素类单体混合物的催眠活性进行了研究，为五味子药材质量标准的完善以及五味子资源的开发利用提供了科学依据。