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《吉林大学》 2015年
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产气荚膜梭菌B型C58-1株α、β1和ε毒素的高效表达与免疫效力评价及生产工艺改进

林初文  
【摘要】:产气荚膜梭菌,又名魏氏梭菌,能引起人类气性坏疽和多种动物的坏死性肠炎及肠毒血症,是近年来导致我国家畜“猝死症”的主要病原。利用梭菌培养过程中产生的毒素可实现梭菌性疾病的有效免疫,因此,培养此类细菌,获得高浓度、强毒力的毒素,可制备免疫效果优良的疫苗。羊三联四防灭活疫苗(羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症)就是其中之一,在我国被广泛使用。目前专业疫苗公司在培养产气荚膜梭菌生产中大多使用厌气肉肝胃酶消化汤作为培养基,该培养基需要牛肉、肝、胃蛋白酶等原材料,产业化生产成本非常高。另一方面,受到上述原材料品质的影响(如肉品的新鲜度、抗生素的残留等),培养基质量不易掌控,进而影响到成品疫苗质量的稳定性。其次,常规苗需大剂量免疫(5 m L/只),且免疫副反应较重。本研究克隆表达产气荚膜梭菌C58-1株α、β1、ε和β1-ε四种毒素蛋白,并通过小鼠和家兔的免疫保护试验验证这四种毒素蛋白作为亚单位疫苗的可能性;同时,优化了具有良好免疫保护力蛋白的高效表达条件,实现其工程化制备。我们克隆了产气荚膜梭菌C58-1株α、β1、ε和β1-ε基因片段,分别构建了表达载体p ETα765、p ETβ1927、p ETε984和p ET1947,并在大肠杆菌BL21获得高效表达。通过Western blotting检测证明表达的四种毒素蛋白均能够与特异的抗体反应,具有良好的反应原性。同时对克隆的C58-1株α、β1、ε和β1-ε基因片段序列进行了分析。α毒素序列与目前所有的A-E型产气荚膜梭菌同源性在61%-100%之间。其中,C58-1株α毒素蛋白序列与C型同源性最低(61%),与B-E型同源性为98%-100%,α毒素在产气荚膜梭菌B-E型中具有相同或相似的功能。β1毒素蛋白序列与所有的B型和C型产气荚膜梭菌具有较高的同源性,其同源性在99.4%-100%之间。ε毒素蛋白序列与所有的B型和D型产气荚膜梭菌具有较高的同源性,其同源性在99.7%-100%之间,产气荚膜梭菌的B型和D型的ε毒素蛋白具有相同或相似的生物学功能,包括免疫学特性。在α、β1、ε和β1-ε四种毒素蛋白对动物免疫保护研究实验中,α和β1毒素蛋白无法完全保护注射致死剂量毒素的小鼠,ε和β1-ε毒素蛋白对产气荚膜梭菌B型和D型提供的免疫保护优于全菌疫苗,其中β1-ε毒素蛋白对产气荚膜梭菌B型、C型、D型均具有保护力。根据中华人民共和国兽药典兽医生物制品制造与检验规程,借鉴羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗的制造及检验规程,采用血清中和法对β1-ε类毒素疫苗进行效力检验,结果证实完全符合国家标准。基于乙酸合成与蛋白诱导表达机制,降低乙酸积累量能够显著提高大肠杆菌表达β1-ε毒素蛋白的水平。考察了p H值、溶氧水平对β1-ε毒素蛋白表达的影响,结果表明,p H值控制在6.5(0-6 h)、7.0(6-16 h)及溶氧水平控制在60%(0-6 h)、30%(6-16 h)时,可显著降低乙酸的积累量,提高菌体生物量及β1-ε毒素蛋白表达量。另外,考察了间歇补料、溶氧反馈补料、p H值反馈补料及恒葡萄糖浓度补料对β1-ε毒素蛋白表达的影响,结果表明在采用分阶段p H值及溶氧控制策略且结合溶氧反馈控制补料时,菌体浓度(OD600为2.045)及β1-ε毒素蛋白表达量(63.24 mg/L)最高,乙酸积累量降低至0.872 g/L。通过对发酵参数筛选及发酵过程控制,降低了乙酸积累量,为实现β1-ε毒素蛋白的工程化制备奠定了基础。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S852.61

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