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《吉林大学》 2016年
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miR-218通过影响MEF2D表达对非小细胞肺癌的作用研究

孙莹  
【摘要】:肺癌是一种致死性恶性疾病,因其预后差、发病率还逐年增加,对它的研究也在大量开展。即便如此,其发生、发展的分子机制仍然没有完全被阐明。最近有报导称,肌细胞增强因子2D(myocyte enhancer factor 2D,MEF2D)可以促进肝癌的生长,但是尚不明确其在肺癌中是否也存在相同或类似的作用。同时,根据现有研究所示,MEF2D激活及过表达促进肿瘤进程的机制是多样的。有趣的是,这些研究在证实MEF2D可以促进肿瘤进程的同时,或多或少都发现了一些可以抑制MEF2D基因过表达的微小RNA(micro RNA,mi RNA)。在证实了MEF2D对肺癌细胞的增殖、凋亡和侵袭能力均有影响后,我们想要进一步研究可以作用于MEF2D基因并抑制其表达的mi RNA。为此,我们查阅了大量文献,并求助于mi RNA及目标基因的在线数据库,最终发现,在MEF2Dm RNA的3'UTR上,有一种mi R-218的mi RNA识别元件(micro RNA recognition element,MRE),而mi R-218可能会抑制肺癌的进程。因此,我们将mi R-218对MEF2D表达的影响作为了第二步研究的目标。因此我们设计了既有区别又相互关联的两个子实验研究mi R-218及MEF2D与肺癌的关联。为了探讨在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中,MEF2家族的表达特点。我们首先重点研究MEF2D表达对非小细胞肺癌的增殖、凋亡及侵袭能力的影响。我们运用q PCR的方法,研究30例非小细胞肺癌患者肺组织及正常组织中,MEF2家族四种基因的表达情况。使用免疫印迹法比较MEF2D在肺癌组织及正常组织中的表达情况。应用免疫荧光染色,明确MEF2D基因所表达的蛋白在肺癌和正常细胞中的分布情况。在正常肺组织细胞高表达MEF2D及沉默肿瘤细胞MEF2D的表达后,通过transwell试验验证MEF2D对细胞侵袭性的影响;通过Brd U试验及ki67表达情况来验证MEF2D对细胞增殖率的影响;通过流式细胞技术来验证MEF2D对细胞凋亡的影响。最后,建立肺癌细胞异种移植小鼠动物模型,将表达MEF2D发夹结构的慢病毒载体和对照载体注射到小鼠肺癌组织中。通过定期测量肿瘤的大小和重量,来验证MEF2D对肺癌体内试验肿瘤增殖情况的影响。通过免疫组织化学技术验证肿瘤切片中MEF2D和ki67的表达情况,侧面反应MEF2D对肿瘤增殖能力的影响。同时,用TUNEL试验来检测体内实验肿瘤细胞的凋亡情况。q PCR试验证实,与正常组织与正常细胞相比,肺癌组织和肺癌细胞中的MEF2D的m RNA表达量显著提高,而MEF2A和MEF2C的表达水平没有显著差异,实验中没有检测到MEF2B的表达。免疫印迹试验证实,MEF2D蛋白在肺癌组织和细胞中异常高表达。免疫荧光染色提示,MEF2D主要存在于肺癌细胞系A549细胞核内,而在正常肺MRC-5细胞中,MEF2D在细胞核内的表达比A549细胞要低,但在细胞质中的表达却高于A549细胞。Transwell试验表明,MEF2D表达水平的增加可以提高MRC-5细胞的侵袭性;Brd U试验和ki67表达情况均表明,MEF2D的过表达能够提高MRC-5细胞的增殖率。转染靶向抑制MEF2D的si RNA后,Brd U试验和ki67表达情况都表明,肿瘤细胞增殖率明显降低;通过流式细胞检测证实,沉默MEF2D后,肿瘤细胞凋亡率增加;transwell试验表明,转染MEF2Dsi RNA可降低A549和H460细胞的侵袭性。在小鼠肺癌细胞异种移植动物模型的相关实验也证实了,注射Lv-scrambled质粒的组织MEF2D广泛表达,而注射Lv-sh MEF2D质粒组,其表达则受到抑制;用TUNEL试验来检测同一肿瘤的细胞凋亡情况,发现注射了Lv-sh MEF2D质粒组呈现明显的阳性染色。综合以上实验结果,抑制MEF2D能够抑制小鼠体内肺癌的生长。我们进一步研究了mi R-218与MEF2D表达的关系,及其对非小细胞肺癌生物学行为的影响;以及mi R-218是否直接作用于MEF2D。我们分别将野生型和突变型MEF2D的3'UTR插入到一种荧光素酶表达载体中,将其分别转染肺癌细胞系及正常肺细胞系。之后,用mi R-218的mimic转染肺癌细胞并用inhibitor转染正常细胞系,通过其表达荧光素酶的情况,来证实其对目标基因MEF2D表达情况的影响。另外,应用q PCR和免疫印迹方法,分别检测不同mi R-218丰度下,肺癌细胞系及正常肺组织细胞中MEF2D的表达情况,从而协助明确mi R-218对MEF2D表达情况的影响。收集10例临床非小细胞肺癌患者的肺癌样本,同时收集相应患者的血清,对其肺癌中MEF2D表达水平进行q PCR检测,同时测量其血清中mi R-218的水平,用以比较两者之间是否存在线性关系。用pc DNA-MEF2D(表达MEF2D m RNA的载体,不受mi R-218调控)和mi R-218 mimics同时转染A549细胞和正常肺细胞。在不同时间点计数细胞以计算其增殖率。同时,利用流式细胞术测定不同组细胞凋亡情况,并对不同组细胞进行Transwell试验以明确其侵袭能力的变化。我们发现将合成的mi R-218 mimics转染A549细胞后,将极大的抑制野生型荧光素酶表达载体荧光素酶的表达,但不会影响突变型荧光素酶的表达。同样,mi R-218 inhibitor增加了正常肺纤维母细胞中荧光素酶的表达,对突变型无影响。q PCR和蛋白印迹方法也证实,mi R-218 mimic能够降低肺癌细胞中MEF2D的表达水平。而mi R-218 inhibitor可以使正常细胞MEF2D的表达增加。另外,对临床肺癌样本中MEF2D行q PCR检验,同时对比相应患者血清mi R-218水平,结果也发现mi R-218跟MEF2D的表达水平存在负相关。之后,用pc DNA-MEF2D和mi R-218同时转染肺癌细胞系,发现mi R-218并没有抑制MEF2D的过表达。通过流式细胞术也证实,即便已经转染了mi R-218的A549细胞,其细胞凋亡仍然被过表达的MEF2D所抑制。Transwell试验也表明,转染了mi R-218 mimics的肺癌细胞中,MEF2D的过表达仍能显著增强肺癌细胞的侵袭性。通过以上的实验,我们认为在非小细胞肺癌组织和细胞中,存在MEF2D的过表达。MEF2D除了具有促进肺癌细胞增殖和侵袭的能力,其过度表达还能够增强肺癌细胞的存活能力。因此,我们可以推断,MEF2D可能是非小细胞肺癌的一种致癌基因。抑制其表达,可以控制非小细胞肺癌的发生和发展,提示MEF2D可能会成为非小细胞肺癌治疗的新靶点。同时,我们也发现mi R-218跟MEF2D的表达水平存在负相关,MEF2D是肿瘤抑制因子mi R-218的目标基因。同时,单纯转染mi R-218mimic而不抑制MEF2D表达对肿瘤无抑制作用,从而证明了mi R-218是通过减少MEF2D表达来抑制肺癌细胞生长。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R734.2

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