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《吉林大学》 2016年
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肠道菌对旋毛虫存活、繁殖及蛋白表达变化影响的研究

姜海燕  
【摘要】:哺乳动物的胃肠道是一个复杂而多样的生态系统,这是在已发现的生态系统中细胞密度最高的系统之一。一个正常成人体内,肠道内的细菌数量可达到1014个,是人体细胞总数的10倍。肠道菌在与人类长期的共进化过程中,对维持肠道免疫系统的稳态发挥着关键的作用,并与宿主的健康及多种疾病息息相关。同时,人类的整个发展史几乎都与寄生虫进化史相生相伴,目前为止,全世界每年仍有数亿人发生寄生虫感染。旋毛虫是一种可以感染包括人在内的多种哺乳动物的寄生虫,感染宿主后其肌幼虫发育到成虫及成虫孵育新生幼虫阶段都在胃肠道中,生活史中此阶段与肠道菌紧密接触。已有的资料表明肠道菌与寄生虫可以相互影响进而影响宿主生理和病理过程。目前对旋毛虫与宿主间的相互影响,及肠道菌对宿主的作用已有大量的研究,然而,旋毛虫与肠道菌间之间存在着怎样的影响,及产生影响的机制却有待于进一步探讨。本实验将旋毛虫成虫200条/孔接入到六孔培养板中,分别与保加利亚乳酸杆菌、嗜酸性乳酸杆菌、大肠杆菌DH5a、酵母菌、沙门氏菌及出血性大肠杆菌O157:H体外共培养,观察不同肠道菌对旋毛虫活力、存活及孵育幼虫的影响,同时将旋毛虫单独培养作为对照。结果发现,共培养24小时后,保加利亚乳酸杆菌和嗜酸性乳酸杆菌显著提高了旋毛虫的存活率和新生幼虫产出率,尤其是保加利亚乳酸杆菌作用最显著(P0.05);同时,显微镜下观察旋毛虫的活力状态结果显示,与乳酸杆菌共培养的旋毛虫活力水平明显高于单独培养组。相反,致病菌沙门氏菌及出血性大肠杆菌O157:H显著抑制了旋毛虫的存活与繁殖(P0.01),尤其是大肠杆菌O157:H的影响最为显著。与大肠杆菌DH5a共培养的旋毛虫活力与对照组相比较无明显区别,共培养24小时后存活率与新生幼虫孵出率均无显著变化。酵母菌提高了了旋毛虫的存活,但是对新生幼虫产出率无明显影响。一氧化氮(NO)作为一种重要的信使分子,在机体多种生理过程中发挥关键的作用,本实验通过格里斯(Griess)试剂法检验旋毛虫与不同菌株共培养24小时后上清中NO水平变化,结果显示,旋毛虫与大肠杆菌O157:H共培养组上清中NO水平与对照组相比显著提高,其他组上清中NO水平较对照组无明显变化。由此推断出血性大肠杆菌O157:H7的存在,诱导旋毛虫一氧化氮生成的增加,参与了旋毛虫的应激反应。为了进一步探讨不同肠道菌诱导的旋毛虫蛋白表达变化,我们采用同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)技术联合液相色谱串联质谱法(LCMS/MS)对旋毛虫与不同菌株(保加利亚乳酸杆菌、大肠杆菌DH5a、酵母菌、出血性大肠杆菌O157:H)共培养后差异表达蛋白进行分析,共计获得23,377个MS/MS色谱峰,10707个不同肽段,鉴定到514个蛋白质,其中158个蛋白质具有定量信息。与对照相比,以差异倍数1.5为基线,得到各组中差异表达蛋白个数:大肠杆菌O157:H上调26个,下调2个;保加利亚乳酸杆菌上调8个,下调5个;大肠杆菌DH5a上调8个,下调3个;酵母菌上下调各1个。可见,大肠杆菌O157:H对旋毛虫蛋白表达变化影响最为显著。差异表达蛋白功能分类和亚细胞定位分析结果表明,差异表达的蛋白主要与新陈代谢功能相关,其次是肌肉运动、蛋白质的合成与降解、信号转导及抗压力反应等功能群。亚细胞定位分析发现,差异表达的蛋白主要定位于细胞浆,其次是细胞核、细胞骨架、线粒体、细胞膜及膜外等部位。我们采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法对旋毛虫与不同菌株共培养后基因表达变化进行了分析,结果表明,丝裂原活化蛋白激酶通路和胰岛素信号通路主要被大肠杆菌O157:H和沙门氏菌激活,大肠杆菌O157:H和沙门氏菌通过调控这两条信号通路的基因表达,从而抑制了旋毛虫的存活与繁殖。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S852.7

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