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《吉林大学》 2016年
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毛囊源性iPS细胞经定行内胚层诱导为肝细胞样细胞的研究

刘小梅  
【摘要】:背景众所周知,i PS细胞具有与ES细胞相似的形态、基因表型及多向分化、自我更新能力,并且回避了ES细胞所面临的伦理学的困扰。目前已有文献报道有关i PS细胞肝向诱导的成功案例,但是仍有许多问题亟待解决。首先,靶细胞的选择是至关重要的。国内、外实验室使用的i PS细胞的重编程靶细胞为:皮肤成纤维细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、脂肪干细胞、脐带血来源CD34+细胞和脐带间充质干细胞等,其中最常见的是皮肤成纤维细胞。本实验室创新性地重编程毛囊间充质干细胞为i PS细胞,建立了毛囊源性i PS细胞系,具有取材广泛、安全、简便、无创等优点。其次,传统的诱导方法是通过拟胚体(EB)阶段进行i PS细胞的肝向诱导。拟胚体途径的主要目的是模拟体内的胚胎发育过程,拟胚体中的三胚层细胞可以互相支持、互相提供细胞生长分化所必需的微环境。但是,由于拟胚体的特殊三维立体结构,其分化后的细胞处于不同的分化阶段,限制了所得成体细胞临床应用的可能性;拟胚体不仅可以分化为肝细胞,亦可分化为胰腺细胞,降低了细胞的纯度;经由拟胚体得到的细胞寿命较短。因此,我们必须探索出一个新的诱导途径,以达到i PS细胞高效肝向诱导的目的。本实验绕过拟胚体阶段,经由定行内胚层阶段,模拟体内肝细胞的生长发育模式,促使i PS细胞向肝细胞样细胞方向分化。本方案显著提高了i PS细胞体外肝向诱导的效率、细胞的寿命及细胞的数量。最后,目前已有的诱导方法仍存在效率较低这个致命的问题,因此我们在诱导方法上进行了优化改良。我们将HGF应用于i PS细胞的肝向诱导中,在诱导的早期,加入了大剂量的HGF,从而有效地促进了定行内胚层形成,遵循了高效性的原则。方法本实验选择毛囊源性i PS细胞为实验对象,对其进行体外诱导,绕过拟胚体阶段,经过定行内胚层向肝细胞样细胞分化,并对所得细胞进行鉴定。本实验具有以下几个优点:(1)本实验室重编程毛囊间充质干细胞,构建了新的毛囊源性i PS细胞系,细胞的来源更加丰富,且取材更加安全、无创、简便;(2)与传统诱导方法相比,我们绕过了拟胚体阶段,经定行内胚层进行i PS细胞的肝向诱导,提高了细胞的纯度与寿命,确保实验的有效性、高效性;(3)我们在诱导的初期使用了大剂量的HGF,从而促进了i PS细胞向定行胚层(DE)的诱导分化,增加了DE形成的比例。结果本实验选用毛囊源性i PS细胞为对象,相差显微镜观察其细胞呈克隆样排列;RT-PCR证实其不表达DE、HLCs的特异性标记基因。经过4天诱导后的定行内胚层细胞,相差显微镜观察其细胞连接断裂,细胞体积变大;RT-PCR证实有DE的特异性标记基因SOX17、FOXa2的表达;免疫荧光染色提示其在蛋白水平上有SOX17的表达。我们得到的HLCs经相差显微镜观察可知其细胞体积较大,呈多角形,细胞核呈圆形;RT-PCR证实具有肝细胞特异性标记基因ALB,AFP,HNF4α,AAT,CYP3A4和CK18的表达;免疫荧光染色表明其在蛋白水平上表达ALB,AFP,CYP3A4和CYP7A1;功能鉴定提示HLCs具有糖原贮存、LDL摄取和ICG摄入和排泄功能。结论本实验选择毛囊源性i PS细胞为靶细胞,取材安全无创。在诱导方法上,我们首先选择了经定行内胚层进行诱导,避免了拟胚体阶段,从而提高了细胞寿命和诱导效率,其次,我们在诱导的初期加入大剂量的HGF,大大促进了定行内胚层的形成,从而保证i PS细胞能够迅速、有效的向肝细胞样细胞诱导分化。通过我们的方法,可以大量地生产i PS源性肝细胞样细胞,为广大的肝衰病人带来福音和生命的希望。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R575

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