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《吉林大学》 2017年
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基于RNA-seq技术的乙肝相关肝硬化肝细胞转录组学研究

王欢  
【摘要】:背景和目的在肝脏疾病的治疗中,针对病因的抗病毒治疗及针对症状抗肝纤维化治疗均非常重要。目前,随着核苷(酸)类药物的普及以及DAA的出现,CHB和CHC的治疗已取得飞跃进展,并在很大程度上逆转了肝纤维化的进程。但对于已经形成的肝硬化的逆转和治愈仍是难于解决的问题。所以抗纤维化,特别是抗肝硬化的治疗就成了当前需要亟待解决的难题。随着新一代测序技术的出现,转录水平的研究也越来越多,但肝硬化相关的转录组学研究,多取材于肝组织,是多种细胞的混合物,并且以实验动物的研究为多。有关单一种类细胞水平的研究,特别是来自病人的细胞水平的转录组学研究非常少见。本研究拟利用病人肝细胞,采用RNA-Seq技术研究乙肝相关肝硬化发生发展过程中肝细胞的表达谱改变,筛选出肝硬化特异性的m RNA和lnc RNA,以期发现肝纤维化,肝硬化的发病机制,找到肝纤维化,肝硬化治疗相关的分子靶点。方法本研究采用改良的EGTA/胶原酶四步灌流法分离正常肝组织及硬化肝组织中的原代肝细胞。经胶原酶消化肝组织后采用密度离心及Percoll梯度密度离心法分离纯化原代肝细胞。采用台盼蓝拒染观察细胞活性,细胞计数板计数细胞数量。评价患者年龄、肝脏重量、热缺血时间(WIT)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、总胆红素(total bilrubin,TBIL)等对肝细胞活性及数量的影响。选取分离得到的5例正常肝细胞和6例乙肝相关肝硬化肝细胞。Trizol法提取细胞中的总RNA并用Agilent 2100鉴定合格后采用RNA-seq技术进行转录组测序。对得到的m RNA和lnc RNA进行转录组表达谱分析,采用火山图,聚类分析等方法,筛选出肝硬化相关的差异表达m RNA和lnc RNA。继而利用生物信息学方法对肝硬化相关的差异表达的m RNA和lnc RNA进行GO和KEGG分析,差异表达lnc RNA-m RNA互作分析;预测差异表达m RNA和lnc RNA可能参与的生物学功能。根据生物信息学结果及文献查阅找出具有研究价值的差异表达基因。结果本研究共对41例患者肝组织进行了原代肝细胞的分离,其中20块成功分离出原代肝细胞。肝硬化组12例,无肝硬化(正常组)8例。患者的平均年龄为49±13.75岁,肝组织块重量为63.9±17.42g,WIT为3.31±1.57h,ALT为142.41±217.46 U/L,TBIL为58.35±90.30umol/l。获取肝细胞的数量和活性分别为24.4±13.83×105/g,83.3%±8.44。相较于正常组,肝硬化组WIT长,TBIL水平高,且两组间有统计学差异(p≤0.05),但患者的年龄、肝脏重量、ALT水平无明显差异;肝硬化组分离获取肝细胞的数量和活性均较正常组差(p≤0.05)。当WIT≤3h,肝脏重量≤60g,TBIL≤30umol/l时,分离获取的肝细胞数量和活性不受上述因素影响,当超过上述范围后,细胞的数量及活性呈下降趋势;细胞数量和活性与患者的年龄、ALT水平无明显相关性。通过RNA-seq技术,我们发现了与肝硬化相关的190条差异表达m RNA,上调的2条,下调的188条;87条差异表达lnc RNA,上调的55条,下调的32条;72489个差异剪接基因(differentially splicing genes,DSGs)。对差异表达m RNA和lnc RNA进行GO和KEGG分类和功能富集分析,我们发现差异表达的m RNA参与肝硬化的多种生物学过程,如物质代谢、炎症反应、多种酶的活性调节等过程。病毒感染性疾病相关的通路共富集了14个差异表达m RNA,分别为FGL2、CHEK1、RANBP3L、FGB、WDR72、PTTG3P、ANKRD37、CYCSP52、IL18、C3P1、AZGP1、POLR3GL、TBPL1、novel_G001217,其中FGL2、IL18、AZGP1是已知与肝硬化明确相关的。差异表达的lnc RNA共表达m RNA显著富集的病毒感染性疾病基因为AKT1、KLHDC2、SH3BP4、RANBP1、TRAF5、WNT2B。显著富集的通路包括酒精中毒和病毒致癌,病毒致癌通路中的SRC与HBV致癌相关。lnc RNA-m RNA互作分析共发现6条lnc RNA和13条m RNA。XLOC_058660同时调节11个m RNA的表达,UGT1A1同时被4个lnc RNA调节。差异剪接分析发现发生2次及以上DSGs有PZP、AFM、RNF121、ATF3、DNAH14、BHLHE40、ELF3、GMDS-AS1、L3MBTL4、LOC728040、PPOX、WASH3P。结论本研究前期采用EGTA/胶原酶四步灌流法成功地从正常及硬化的肝组织中分离出数量及活性均较好的原代肝细胞。应尽量减少WIT时间,修整肝脏使之形态及重量均适宜灌注以提高细胞数量及活性。从原代肝细胞水平建立了肝硬化相关差异表达m RNA和lnc RNA谱,为筛选肝硬化相关靶基因提供了依据;预测差异表达m RNA和lnc RNA可能参与了肝硬化发生发展的多条信号通路;预测了差异表达lnc RNA可能调控的m RNA;寻找到了可能与肝硬化相关的DSGs。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R575.2;R512.62

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