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基于生物信息学筛选急性心肌梗死潜在生物标志物及调控靶点

陈佳琦  
【摘要】:急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是冠心病最严重的类型之一,是由冠状动脉血管部分或完全闭塞所引起的部分心肌因持续性缺血、缺氧而导致的心肌组织局部坏死。2012年WHO报告显示,全世界因心血管疾病死亡的患者有1750万,2013年在我国由心血管疾病导致的350万人死亡中,约有250万(71%)是由心肌梗死导致的死亡。因此,心肌梗死已经成为心血管疾病死亡的最主要原因。目的近几十年,急性心肌梗死的治疗已经取得了重要进步,然而急性心肌梗死仍是一类致死率极高的危重疾病。急性心肌梗死因具有病前期症状不明显、突发性及致死率高等特点,为预防、诊断和治疗该疾病带来一定难度,所以临床上仍然需要能够快速诊断和有效调控的理想生物标志物。随着基因芯片技术的发展,对来源于急性心肌梗死患者外周血芯片数据进行合理的分析和利用,能够使人们在分子水平上更准确地了解这一严重心脏疾病的发生与发展。利用基因芯片表达谱数据分析挖掘急性心肌梗死的潜在调控靶点,能够有效地了解该疾病的潜在诱因,明晰急性心肌梗死基因层面上的发病机制,或可为该疾病的诊断和治疗提供新的策略。本研究将结合生物信息学分析方法,对急性心肌梗死患者外周血芯片表达谱数据进行再次挖掘,通过筛选差异表达基因、分析功能与通路富集、基因间相互关系、基因共表达关系等方法,筛选急性心肌梗死的潜在调控靶点,为进一步分析急性心肌梗死的潜在调控靶点和可能的调控机制提供依据。课题组前期工作已经证实,曲古菌素A(trichostatin A,TSA)能够抑制多种炎症因子的产生和心肌细胞凋亡,对多种心脏疾病模型都有明显疗效。在急性心肌缺血大鼠模型中,TSA干预作用显著,能够减少心肌梗死面积,改善心脏功能,减轻炎症程度,抑制心肌细胞凋亡,保护心肌组织结构等功能[1],但其具体的调控机制仍不甚清晰。方法从GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中下载数据GSE48060。这一数据来源于31例入院24h急性心肌梗死患者外周血样本和21例健康对照样本,对原始数据进行标准化预处理。1、筛选差异表达基因与构建相互作用网络。采用Limma软件包计算差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),设置筛选条件为:P-value0.05及Fold change1.2。基于Gene ontology(GO)database对DEGs进行GO功能注释分析;基于Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)对DEGs进行Pathway富集分析;基于GO的层次结构构建基因功能调控网络;基于Pathway间的相互调控关系,构建信号通路调控网络;基于KEGG数据库对基因间相互作用构建基因间相互作用网络;基于JASPAR数据库构建差异表达基因的转录因子调控网络。2、构建基因共表达网络及验证枢纽基因。计算每对差异表达基因间Pearson相关系数和K-core值,构建差异基因共表达网络;基于权重基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis,WGCNA)获得基因模块、权重基因共表达网络、枢纽基因及基因模块的功能及通路富集分析结果。收集20例急性心肌梗死患者和15例健康对照者外周血样本,经RT-PCR验证枢纽基因的表达水平。3、枢纽基因TBX21的临床意义分析。结合生物信息学分析结果与临床样本验证结果,筛选出最为相关的枢纽基因TBX21。再次收集急性心肌梗死患者38例和健康对照者25例的外周血样本,提取外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)及分离血清,使用Elisa试剂盒检测血清中IFN-γ和IL-4含量;采用RT-PCR检测PBMCs中枢纽基因TBX21及与TBX21密切相关的GATA-3、IFN-γ和IL-4的mRNA水平。分析38例患者心肌损伤指标、血常规炎症细胞指标、心血管疾病危险因素及冠脉狭窄积分,采用统计学方法对数据进行处理,并与TBX21水平进行相关性分析,以确定TBX21作为急性心肌梗死潜在调控靶点的可能性。4、动物模型验证枢纽基因TBX21表达。建立大鼠急性心肌梗死模型,结扎冠状动脉左前降支的方法制备模型,1天、3天和7天后处死大鼠,腹主动脉取血并收集心脏;采用TTC染色法检测心肌梗死面积;采用HE染色法观察心肌组织形态变化;腹主动脉采血分离大鼠外周血单个核细胞,采集大鼠梗死心肌组织,RT-PCR检测PBMCs和梗死心肌组织中TBX21和GATA-3mRNA的表达情况;Western-blot检测大鼠心肌组织中TBX21蛋白表达情况;Elisa检测心肌梗死大鼠血清中IFN-γ和IL-4表达情况。5、TSA干预实验。制备急性心肌梗死大鼠模型,给予曲古菌素A(TSA),检测心肌梗死面积、心肌组织形态变化、血清中IFN-γ和IL-4表达、TBX21蛋白水平和大鼠心肌组织及PBMCs中TBX21和GATA-3 mRNA水平。结果1、分析GEO数据库中下载的急性心肌梗死芯片表达谱数据GSE48060,急性心肌梗死组与健康对照组相比,共获得差异表达基因551个,其中164个基因发生上调,387个基因发生下调。对DEGs进行GO和Pathway富集分析、构建基因间相互作用网络、基因功能调控网络及信号通路调控网络可知,当急性心肌梗死发生会涉及以炎症反应为主的生物进程(BP),包括:炎症反应(GO:0006954),趋化作用(GO:0006935),免疫反应(GO:0006955);主要涉及的关键信号通路为趋化因子信号通路(PATH:04062)、Toll-样受体信号通路(PHAT:04620)和JAK/STAT信号通路(PHAT:04630)等。2、使用急性心肌梗死组与健康对照组中的DEGs作为WGCNA的数据源进行分析,共获得4个与炎症反应、免疫反应、细胞防御反应、血小板激活及血液凝固等GO分类紧密相关的基因模块(blue、brown、yellow和turquoise模块);通过对模块与炎症及免疫反应进行相关性分析,确认模块blue和brown为炎症模块。构建blue和brown模块基因的共表达网络,综合模块基因的GS、MM和IC值、模块基因共表达网络中的Degree和K-core值,以及参与炎症及免疫反应相关GO term的基因列表,筛选出候选枢纽基因。采用RT-PCR方法检测20例急性心肌梗死患者与15例健康对照样本的结果显示,有8个枢纽基因在急性心肌梗死患者PBMCs中的表达变化趋势与生物信息学分析结果一致,且TBX21、AQP9、PRF1和NFIL3变化最为显著;最后,根据差异表达基因的转录因子及其靶点调控网络,获得TBX21为转录因子调控网络中的核心转录因子,由此推测TBX21与急性心肌梗死的发生发展密切相关,可能成为急性心肌梗死的潜在生物标志物及可能的调控靶点。3、38例急性心肌梗死患者与25例健康对照样本检测结果表明,与对照组相比,急性心肌梗死患者PBMCs中TBX21和GATA-3水平显著下降;Elisa结果显示,与对照组相比,急性心肌梗死患者血清中IFN-γ表达上调,IL-4表达下调。TBX21的临床意义分析提示,TBX21水平与冠状动脉狭窄程度(Gensini积分)呈负相关;与心血管疾病危险因素中的血肌酐、纤维蛋白原及甘油三酯密切相关。4、采用RT-PCR方法检测急性心肌梗死大鼠心肌组织和PBMCs中TBX21mRNA的表达。与对照组相比,模型组大鼠心肌组织和外周血中TBX21mRNA水平显著下降;Western-blot结果显示,心肌组织中TBX21蛋白水平第一天显著下降随后缓慢恢复;Elisa检测结果显示,急性心肌梗死大鼠血清中IFN-γ表达上调,IL-4表达下调。上述分析结果与临床样本检测结果相一致。5、TSA能够上调急性心肌梗死大鼠心肌组织与PBMCs中TBX21mRNA水平;上调TBX21的蛋白表达;TSA抑制急性心肌梗死大鼠血清中IFN-γ与IL-4的表达异常,能够减少心肌梗死面积,减轻缺血损伤所致心肌组织形态变化。结论1、运用生物信息学分析方法筛选出与急性心肌梗死发生发展密切相关的候选枢纽基因,收集临床样本,验证结果表明有8个枢纽基因的表达变化趋势与生物信息学分析结果一致,分别是NCF4、AQP9、NFIL3、DYSF、GZMA、TBX21、PRF1和PTGDR。差异最为显著的关键转录因子TBX21可能成为急性心肌梗死的潜在生物标志物及可能的调控靶点。2、临床样本分析结果表明,TBX21水平与急性心肌梗死患者肌酐、纤维蛋白原、甘油三酯及冠脉狭窄程度显著相关。3、急性心肌梗死大鼠模型中,TBX21 mRNA水平、蛋白水平显著下降;TSA能够恢复TBX21的表达异常。综上,TBX21可能作为急性心肌梗死潜在调控靶点。


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