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《吉林大学》 2017年
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金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysGH15的抗原性及其代谢动力学

张蕾  
【摘要】:金黄色葡萄球菌是一种普遍存在的人畜共患病原菌,其可以造成多种局部和全身性感染,具有高发病率和死亡率。由金黄色葡萄球菌引起的感染是威胁人类健康的主要问题。严重地威胁人类的健康和公共卫生安全。近些年,由于多重耐药金黄色葡萄球菌的广泛流行,给该菌造成感染的治疗带来了巨大的困难。噬菌体裂解酶可以高效、特异地裂解细菌,因其与抗生素的作用机制完全不同,是新概念的抗菌物质,有着很大的研究与应用潜力。本实验室在前期研究过程中获得了金黄色葡萄球菌的噬菌体裂解酶(LysGH15),该裂解酶对金黄色葡萄球菌具有广谱、高效裂解活性,不但可以杀灭抗生素敏感的金葡菌,对多重耐药的金葡菌同样有效;已成功解析了LysGH15的三维结构、揭示了其高效杀菌活性的分子作用机制;LysGH15在体内表现出良好的治疗效果。但作为一种潜在的新型蛋白酶类药物,LysGH15是否会诱导金葡菌产生耐药性,其在体内的抗原性和代谢动力学尚不清楚,而这是其作为药用必须回答的科学问题。因此,本论文将继续深入研究LysGH15,以揭示LysGH15重复应用之后,金葡菌是否能够产生针对其的耐药性,LysGH15进入体内后能否刺激机体产生抗体,所产生的抗体是否会对其体内的疗效产生不利影响;重复和大剂量应用该裂解酶是否会对机体造成损伤;通过免疫学鉴定法,深入研究该裂解酶在体内的药代动力学特性。为进一步的验证裂解酶LysGH15在治疗不同感染模型过程中的抗药性及免疫原性,本论文还对裂解酶LysGH15在治疗小鼠皮肤烧烫伤的效果进行了深入研究。首先,我们发现LysGH15在与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)或甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)菌株重复作用之后,未引起金葡菌产生针对LysGH15的抗性,且每一代作用的菌株对LysGH15的敏感性没有变化。表明在实验期间,LysGH15不会诱导金葡菌产生抗性。进一步的体内研究表明,LysGH15可以刺激小鼠产生针对LysGH15的特异性抗体,在一次性应用后第三周抗体水平为(1:512),且主要为Ig G。将LysGH15多次重复免疫大白兔之后得到了高免血清,将血清中的抗体进行纯化。体外活性实验表明抗体不影响LysGH15对金黄色葡萄球菌的结合能力和裂解活性。进一步的体内治疗实验表明,当用LysGH15一次性免疫的小鼠抗体滴度达到最高时,单次静脉注射LysGH15(50μg)仍然可以有效地治疗被致死剂量感染的小鼠模型,治疗效果未受到影响。为了分析LysGH15在大鼠体内的药代动力学,本研究以制备并纯化的无标签LysGH15-165(CHAP片段)的兔源多克隆抗体为包被抗体,同时以HRP标记的抗HIS标签的单克隆抗体作为检测抗体,建立了一种灵敏的双抗体夹心方法。通过实验确定最后的包被抗体(LysGH15-165)与检测抗体(HRP-anti-HIS)的稀释比例为包被抗体(1:800)(3.2μg/m L),检测抗体(1:1600)(0.6μg/m L);以纯化后LysGH15蛋白为标准品对该方法进行了平行度、准确度(日内和日间变异)、稳定性的检测。实用工作范围约为0.6-300μg/m L,回收范围从91.2至100.53%,而日内和日间准确度的变异系数分别为≤8.31%和≤12.81%。当不同浓度的裂解酶溶液在-80℃反复冻存1次、2次及3次,其回收率会明显下降(40.87%-77.23%),但是当裂解酶保存在-80℃1个月、2个月以及4个月,其回收率在84.18%-101.61%,说明血浆样品(含有LysGH15)在-80℃放置4个月稳定,没有降解。并且也考察了主要的组织器官,心、肝、脾、肺、肾、胃、肠及肌肉注射点夹心酶联免疫吸附测定(Sandwich-ELISA)方法的准确度(日内和日间变异)、稳定性。本研究以尾静脉注射裂解酶LysGH15的方式,检测其在血液中的药代动力学参数,给予每只大鼠剂量12.5 mg/kg裂解酶及buffer,药物在血浆中的消除半衰期t1/2:mean=10.529 h;AUC(0-t):mean=320.164 mg/L*h;AUC(0-∞):mean=345.986 mg/L*h;达峰时间Tmax:mean=0.083h;最大血药浓度Cmax:mean=195.839 mg/L;平均滞留时间MRT为3.928 h;大鼠在每只给药剂量12.5 mg/kg裂解酶1h,LysGH15主要分布在血液、小肠、肾中,其中小肠的含量最大,在注射6h后,LysGH15主要分布在肾、胃、小肠内,在血液中的含量已经较小;给药24h后小肠、肾脏、胃中药物含量减少,但能检测到其存在。通过免疫组化实验进一步证明应用LysGH151h之后,即可在小肠、肾脏、胃检测到裂解酶;而6h后,在肾、肠和胃可以检测到较高的裂解酶的含量;24h后,药物在减少,但仍可以观测到。对裂解酶LysGH15进行了急性毒性及亚慢性毒性测定,在急性毒性试验中,通过腹腔一次性使用高剂量LysGH15(10 mg)并未发现动物机体有不适症状,主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠)也无病理变化。对雌雄大鼠腹腔注射并给予不同浓度剂量的LysGH15连续注射4周,其血液学指标和血生化指标均在标准范围内,说明长期注射LysGH15不会对机体产生毒性反应;且HE切片染色也未发现病理变化。为进一步的验证裂解酶LysGH15在治疗不同感染模型过程中的抗药性及免疫原性,本实验还建立了小鼠皮肤烧烫伤感染模型,并且评价了裂解酶LysGH15在体外烧烫伤模型中的治疗潜力。首先将LysGH15和中药单体芹菜素api加入到Aquaphor中以形成LAA软膏,LAA软膏同时表现出对金黄色葡萄球菌的杀菌活性和溶血抑制活性。在MRSA的小鼠皮肤感染模型中,LAA治疗组伤口皮肤中的细菌菌落计数在处理后18小时内约为102 CFU/mg(最终检测不到),而未治疗组的小鼠皮肤菌落计数约为106 CFU/mg。LAA软膏在治疗小鼠感染MRSA的皮肤模型中有效降低了促炎细胞因子的分泌、加速皮肤伤口愈合、促进伤口组织中巨噬细胞Ⅱ型相关标志物(精氨酸酶I和YM1)的转录水平。本研究为将LysGH15作为治疗耐药金葡菌感染的新型抗菌蛋白酶类药物提供坚实的理论与实验基础。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.61

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