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《吉林大学》 2017年
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Snapin在猪血凝性脑脊髓炎病毒诱导神经细胞自噬中的功能研究

丁宁  
【摘要】:猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)属于β冠状病毒属的成员,是造成临床上感染病猪出现典型脑脊髓炎症状的主要病原体之一。PHEV主要危害仔猪,尤其是哺乳期仔猪感染后,死亡率可达20~100%。PHEV感染机体后主要导致神经损伤。在脑组织中,神经细胞是该病毒复制的场所,未见其感染胶质细胞的证据。通常情况下,病毒对细胞的入侵会激发细胞的免疫应激反应,旨在清除外源入侵的病原体以维持细胞稳态,但病毒也可利用细胞内的一些成分为其复制提供原材料,进而造成机体的损伤。细胞自噬是病原体侵害细胞过程中发挥上述作用的一个重要过程。现已证实,细胞自噬与肿瘤、神经退行性疾病、代谢相关疾病、免疫性疾病等发病过程密切相关,而且在多种病毒、细菌等病原体感染细胞过程中均有细胞自噬诱导或抑制现象的发生。如前所述,PHEV在体内主要感染神经细胞,其感染过程是否能诱导神经细胞的自噬现象,目前尚未见报道。因此,为了明确PHEV是否能够诱导神经细胞发生自噬,我们通过一系列自噬的相关实验对该过程进行研究。将PHEV感染小鼠神经瘤母细胞(N2a细胞),通过透射电镜观察发现,在胞浆内有典型的双层或单层膜结构的自噬体生成。此外,利用间接/直接免疫荧光以及Western blot实验,发现PHEV能够促使GFP-LC3在N2a细胞内形成荧光聚点,并促进LC3蛋白的型别转化,说明PHEV感染能够诱导神经细胞自噬的发生。然而,在PHEV感染的过程中,自噬底物蛋白p62蛋白并没有发生降解,同时利用氯喹(CQ)处理后,PHEV的感染也显著下调。随后,针对自噬溶酶体降解的过程我们进行了进一步的研究,在串联标记的荧光报告基因mRFP-GFP-LC3(ptfLC3)转染N2a细胞,以及利用酸性晚期内体和溶酶体标记物LysoTracker标记N2a细胞中,我们发现PHEV感染组中,自噬体并没有与溶酶体融合,ptfLC3荧光报告质粒显示未淬灭,并且GFP-LC3与LysoTracker也未见共定位的现象。同时,针对溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)的表达情况进行分析表明,PHEV感染导致LAMP1发生了异常积累,并随感染时间的延长而加剧,进一步说明PHEV抑制了自噬体与溶酶体的融合。根据上述研究结果,说明PHEV能够诱导自噬并引起一种不完全的自噬效应。为了进一步明确PHEV诱导神经细胞自噬的机制,我们利用酵母双杂交系统筛选PHEV在诱导自噬过程中的互作蛋白。经过初步筛选以及测序鉴定,得到14个候选的互作基因,对结果进行分析,确定Snapin蛋白可能参与PHEV诱导自噬的过程。Snapin蛋白是一种新型的小分子蛋白,其不仅在囊泡运输机制中发挥转运功能,并且在晚期内体的降解以及自噬溶酶体形成过程中发挥重要作用。随后,我们首先利用酵母双杂交回转实验、免疫共沉淀以及直接/间接免疫荧光等方法,验证了二者之间的相互作用。在细胞中过表达Snapin蛋白后感染PHEV,病毒的复制并没有发生明显的改变,而利用siRNA干扰细胞内源性Snapin蛋白的表达后感染PHEV,却发现病毒的复制量受到明显抑制。同时,对LAMP1进行检测发现,自噬溶酶体的积累与对照组相比明显增多。该结果进一步证实了Snapin蛋白参与了PHEV感染的过程,并很有可能与PHEV诱导不完全自噬效应有关。上述结果不仅为PHEV致神经损伤的机制研究奠定了基础,而且将为其能够作为神经退行性疾病模型提供重要的理论依据。
【关键词】:猪血凝性脑脊髓炎病毒 自噬 神经损伤 Snapin蛋白 酵母双杂交
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65
【目录】:
  • 中文摘要5-7
  • Abstract7-13
  • 英文缩写词13-15
  • 前言15-17
  • 第一篇 文献综述17-57
  • 第1章 猪血凝性脑脊髓炎病毒的研究进展17-25
  • 1.1 PHEV的结构研究概述17-22
  • 1.1.1 PHEV的结构及特征17-18
  • 1.1.2 PHEV的基因组结构及其编码蛋白的生物学特征18-22
  • 1.2 PHEV致病机制22-25
  • 第2章 哺乳动物细胞自噬的研究进展25-51
  • 2.1 细胞自噬的一般介绍25
  • 2.2 细胞自噬的分类25-31
  • 2.2.1 巨自噬25-27
  • 2.2.2 微自噬27-28
  • 2.2.3 伴侣介导的自噬28-31
  • 2.3 自噬调节机制31-38
  • 2.3.1 巨自噬的调节机制31-32
  • 2.3.2 自噬体的形成32-33
  • 2.3.3 自噬体的对接和融合33-34
  • 2.3.4 自噬的潜在的核调节机制34-38
  • 2.4 病毒与细胞自噬38-51
  • 2.4.1 病毒对自噬的影响39-42
  • 2.4.2 自噬与病毒的关系42-51
  • 第3章 Snapin蛋白的研究进展51-57
  • 3.1 Snapin蛋白概述51
  • 3.2 Snapin蛋白的主要功能51-54
  • 3.2.1 Snapin调控物质在体内的运输51-52
  • 3.2.2 Snapin能够维持神经突触稳态52-54
  • 3.3 Snapin与病原微生物54-57
  • 3.3.1 Snapin与相应病原体的蛋白的相互作用54
  • 3.3.2 Snapin与神经退行性疾病的相关性54-57
  • 第二篇 研究内容57-111
  • 第1章 猪血凝性脑脊髓炎病毒感染诱导N2a细胞自噬的发生57-81
  • 1.1 材料与试剂57-58
  • 1.1.1 细胞、病毒和质粒57-58
  • 1.1.2 试剂58
  • 1.1.3 主要仪器设备58
  • 1.2 实验方法58-64
  • 1.2.1 相关溶液配制58-59
  • 1.2.2 PHEV的扩增与病毒增殖的定量PCR检测方法59-60
  • 1.2.3 利用透射电镜观察自噬体60-61
  • 1.2.4 GFP-LC3B转染细胞检测病毒对LC3的影响61
  • 1.2.5 Western blot对自噬相关基因的检测61-62
  • 1.2.6 PHEV诱导细胞自噬流的检测62-63
  • 1.2.7 药物配制及细胞处理63
  • 1.2.8 CCK-8 试验检测药物对N2a细胞活性的检测63-64
  • 1.3 实验结果64-77
  • 1.3.1 GFP-LC3质粒的酶切鉴定64
  • 1.3.2 利用透射电镜观察PHEV感染N2a细胞后诱导自噬体样结构的形成64-66
  • 1.3.3 PHEV感染N2a细胞后诱导GFP-LC3荧光斑点的形成66-67
  • 1.3.4 PHEV感染N2a细胞后引起自噬相关蛋白的变化67-68
  • 1.3.5 PHEV诱导自噬体生成但抑制自噬溶酶体降解68-75
  • 1.3.6 药物刺激自噬对PHEV的影响75-77
  • 1.4 讨论77-79
  • 1.5 小结79-81
  • 第2章 酵母双杂交筛选与PHEV S1蛋白相互作用的自噬相关蛋白81-99
  • 2.1 材料与试剂81-85
  • 2.1.1 细胞与菌株81
  • 2.1.2 载体81-82
  • 2.1.3 主要试剂82-83
  • 2.1.4 主要仪器和设备83
  • 2.1.5 主要溶液及试剂的配制83-85
  • 2.2 实验方法85-90
  • 2.2.1 PHEV-S1基因目的片段的扩增85-87
  • 2.2.2 p MD18-T-PHEV-S1重组克隆载体的构建87
  • 2.2.3 诱饵载体的构建87-89
  • 2.2.4 PHEV-S1诱饵蛋白筛选酵母双杂交c DNA文库89-90
  • 2.2.5 酵母回转实验(即重组诱饵载体p GBKT7-PHEV-S1与猎物质粒p GADT7-Snapin共转化酵母感受态细胞)90
  • 2.3 实验结果90-95
  • 2.3.1 PHEV-S1基因目的片段的扩增90-91
  • 2.3.2 p MD18-T-PHEV-S1重组克隆载体的构建结果91
  • 2.3.3 诱饵重组载体的构建结果91-92
  • 2.3.4 诱饵蛋白的自激活检测和毒性检测92
  • 2.3.5 重组蛋白在酵母细胞中的表达情况92-93
  • 2.3.6 PHEV-S1诱饵蛋白筛选酵母双杂交c DNA文库93-94
  • 2.3.7 酵母回转实验结果94-95
  • 2.4 讨论95-97
  • 2.5 小结97-99
  • 第3章 Snapin蛋白在PHEV感染中的功能分析99-111
  • 3.1 材料与试剂99-101
  • 3.1.1 细胞、菌株、病毒及相关载体99
  • 3.1.2 相关试剂、抗体和试剂盒99-100
  • 3.1.3 主要的实验仪器100
  • 3.1.4 主要溶液的配制100-101
  • 3.2 实验方法101-103
  • 3.2.1 检测Snapin在PHEV感染中的变化101
  • 3.2.2 间接/直接免疫荧光实验101-102
  • 3.2.3 免疫共沉淀实验102
  • 3.2.4 Snapin si RNA干扰效率检测102-103
  • 3.3 实验结果103-108
  • 3.3.1 PHEV感染后Snapin的变化103-104
  • 3.3.2 直接免疫荧光对PHEV-S1和Snapin的互作进行检测104
  • 3.3.3 PHEV S1蛋白与Snapin相互作用104-105
  • 3.3.4 Snapin影响PHEV的复制105-106
  • 3.3.5 利用间接免疫荧光检测Snapin在PHEV感染后的N2a细胞中的定位变化106
  • 3.3.6 利用间接免疫荧光和WB检测PHEV感染的N2a细胞中的Snapin与LC3106-107
  • 3.3.7 Western blot检测过表达Snapin与干扰Snapin后相关蛋白的变化107-108
  • 3.4 讨论108-110
  • 3.5 小结110-111
  • 结论111-113
  • 参考文献113-143
  • 攻读博士期间发表的学术论文143-145
  • 导师及作者简介145-147
  • 致谢147

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