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《吉林大学》 2017年
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Snapin在猪血凝性脑脊髓炎病毒诱导神经细胞自噬中的功能研究

丁宁  
【摘要】:猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)属于β冠状病毒属的成员,是造成临床上感染病猪出现典型脑脊髓炎症状的主要病原体之一。PHEV主要危害仔猪,尤其是哺乳期仔猪感染后,死亡率可达20~100%。PHEV感染机体后主要导致神经损伤。在脑组织中,神经细胞是该病毒复制的场所,未见其感染胶质细胞的证据。通常情况下,病毒对细胞的入侵会激发细胞的免疫应激反应,旨在清除外源入侵的病原体以维持细胞稳态,但病毒也可利用细胞内的一些成分为其复制提供原材料,进而造成机体的损伤。细胞自噬是病原体侵害细胞过程中发挥上述作用的一个重要过程。现已证实,细胞自噬与肿瘤、神经退行性疾病、代谢相关疾病、免疫性疾病等发病过程密切相关,而且在多种病毒、细菌等病原体感染细胞过程中均有细胞自噬诱导或抑制现象的发生。如前所述,PHEV在体内主要感染神经细胞,其感染过程是否能诱导神经细胞的自噬现象,目前尚未见报道。因此,为了明确PHEV是否能够诱导神经细胞发生自噬,我们通过一系列自噬的相关实验对该过程进行研究。将PHEV感染小鼠神经瘤母细胞(N2a细胞),通过透射电镜观察发现,在胞浆内有典型的双层或单层膜结构的自噬体生成。此外,利用间接/直接免疫荧光以及Western blot实验,发现PHEV能够促使GFP-LC3在N2a细胞内形成荧光聚点,并促进LC3蛋白的型别转化,说明PHEV感染能够诱导神经细胞自噬的发生。然而,在PHEV感染的过程中,自噬底物蛋白p62蛋白并没有发生降解,同时利用氯喹(CQ)处理后,PHEV的感染也显著下调。随后,针对自噬溶酶体降解的过程我们进行了进一步的研究,在串联标记的荧光报告基因mRFP-GFP-LC3(ptfLC3)转染N2a细胞,以及利用酸性晚期内体和溶酶体标记物LysoTracker标记N2a细胞中,我们发现PHEV感染组中,自噬体并没有与溶酶体融合,ptfLC3荧光报告质粒显示未淬灭,并且GFP-LC3与LysoTracker也未见共定位的现象。同时,针对溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)的表达情况进行分析表明,PHEV感染导致LAMP1发生了异常积累,并随感染时间的延长而加剧,进一步说明PHEV抑制了自噬体与溶酶体的融合。根据上述研究结果,说明PHEV能够诱导自噬并引起一种不完全的自噬效应。为了进一步明确PHEV诱导神经细胞自噬的机制,我们利用酵母双杂交系统筛选PHEV在诱导自噬过程中的互作蛋白。经过初步筛选以及测序鉴定,得到14个候选的互作基因,对结果进行分析,确定Snapin蛋白可能参与PHEV诱导自噬的过程。Snapin蛋白是一种新型的小分子蛋白,其不仅在囊泡运输机制中发挥转运功能,并且在晚期内体的降解以及自噬溶酶体形成过程中发挥重要作用。随后,我们首先利用酵母双杂交回转实验、免疫共沉淀以及直接/间接免疫荧光等方法,验证了二者之间的相互作用。在细胞中过表达Snapin蛋白后感染PHEV,病毒的复制并没有发生明显的改变,而利用siRNA干扰细胞内源性Snapin蛋白的表达后感染PHEV,却发现病毒的复制量受到明显抑制。同时,对LAMP1进行检测发现,自噬溶酶体的积累与对照组相比明显增多。该结果进一步证实了Snapin蛋白参与了PHEV感染的过程,并很有可能与PHEV诱导不完全自噬效应有关。上述结果不仅为PHEV致神经损伤的机制研究奠定了基础,而且将为其能够作为神经退行性疾病模型提供重要的理论依据。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65

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