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《吉林大学》 2017年
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牛病毒性腹泻病毒诱导的细胞自噬对病毒感染影响机制研究

周玉龙  
【摘要】:牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)属于黄病毒科(Flaviviridae),瘟病毒属(pestivirus)。根据对上皮细胞的细胞病变效应,可分为两种生物型:致细胞病变型(Cytopathic biotype,CP)和非致细胞病变型(Noncytopathic biotype,NCP)。BVDV能够感染牛、鹿等多种反刍兽,引起的临床症状复杂多样,尤其是BVDV引起的持续感染(PI)牛作为传染源也可以发展成黏膜病,给养牛业带来巨大经济损失。BVDV的致病机理比较复杂,PI与BVDV逃避先天性免疫反应有关,但具体机制尚不完全清楚。自噬是进化上古老的通路,在机体多种基本的生理过程中起重要作用,包括免疫、存活、分化和维持机体内稳态等。自噬调节常被用于治疗和预防重要的病毒性疾病。然而,目前对于BVDV与自噬之间的相互作用仍然不清楚。因此,我们评价了不同生物型BVDV对自噬的影响,以及细胞自噬对病毒增殖、细胞存活、细胞凋亡和Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)的影响,为探讨BVDV引起PI发生机制和黏膜病防治具有重要意义。本研究针对BVDV与细胞自噬相互作用主要开展了以下几方面的研究:Ⅰ.黑龙江省规模化牛场BVDV流行病学调查及实验毒株的筛选为了筛选BVDV流行毒株用于本研究,对来自黑龙江省不同地区的4个规模化奶牛场10591份血清样本进行抗原检测,筛选阳性样本,调查阳性率以及牛群易感情况。通过病毒分离技术对27份来自不同临床特征的BVDV感染牛样本进行病毒分离鉴定,再对分离毒株5'-UTR和NS2-3部分基因进行克隆测序,通过Mega 6.0进行序列相似性和遗传进化分析。结果BVDV抗原阳性率为2.5%(268/10591),其中成年奶牛BVDV抗原阳性率是0.58%(42/7215),犊牛BVDV抗原阳性率是6.31%(213/3376)(P0.01),表明未成年牛比成年牛更易感BVDV。分离到的27个BVDV毒株均属于细胞病变型。5'-UTR进化分析结果表明分离毒株属于BVDV-1b(29.63%,n=8)、BVDV-1c(29.63%,n=8)、BVDV-1m(7.41%,n=2)和BVDV-1o(33.33%,n=9)。首次在中国本地荷斯坦奶牛群分离到BVDV-1o。87.5%(7/8)的BVDV-1b分离自黏膜病牛;所有的BVDV-1c(10/10)和-1m分离自无症状的奶牛。此外,发现在相同的奶牛场同时存在多个BVDV亚型。所有的BVDV分离株NS2-3基因区存在核苷酸替代,FH-2和YL株在相同的区域出现连续3个核苷酸缺失。根据NS2-3基因系统进化分析结果表明27个BVDV分离株可以分成3个不同基因群(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ群),81.48%(22/27)的BVDV毒株属于Ⅰ群。综上,确定BVDV-1b为主要流行毒株,作为本研究使用毒株。Ⅱ.MDBK细胞自噬评价系统构建为了评价BVDV与MDBK细胞自噬之间的相互影响,构建了GFP-LC3-MDBK细胞系。GFP-LC3-MDBK细胞能够稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)标记的自噬标识蛋白微管蛋白轻链3B(LC3B),在饥饿条件下LC3B-Ⅱ转化率显著升高,能够产生明显的绿色荧光点状聚集。通过RNA干扰技术构建了自噬缺陷型细胞系sh BCN1-MDBK和对照细胞系Control-sh BCN1-MDBK细胞系。在饥饿诱导自噬情况下,sh BCN1-MDBK细胞系与对照组细胞相比Beclin1蛋白表达被显著抑制(P0.05),LC3B-Ⅱ转化率显著下降。说明上述两个细胞系可用于自噬研究的评价。Ⅲ.BVDV感染对MDBK细胞自噬影响为了确定BVDV对MDBK细胞自噬的影响,BVDV感染GFP-LC3-MDBK细胞72h,透射电镜和激光共聚焦显微镜观察结果显示CP型和NCP型BVDV感染组与对照组相比自噬体双层或者单层膜结构和GFP-LC3绿色荧光点数量显著升高(P0.05);免疫印迹实验结果表明LC3B-I到LC3B-II的转化率明显增加(P0.05)。上述结果表明CP和NCP BVDV感染均能诱导MDBK细胞的稳定自噬。另外,自噬抑制剂氯喹能够显著增强LC3B-II的转化率,BVDV感染MDBK细胞以后可以看到溶酶体染料Lysotracker red与GFP-LC3B发生共定位,以上结果说明BVDV能够诱导完全自噬潮。Ⅳ.细胞自噬对BVDV复制的影响为了确定细胞自噬对BVDV复制的影响,通过化学药物制剂调控自噬,以及应用自噬缺陷型细胞系进行相关研究。结果表明雷帕霉素诱导的自噬增强了CP和NCP BVDV的复制(P0.05);3-甲基腺嘌呤抑制自噬减少了CP和NCP BVDV的复制(P0.05);同时BVDV在自噬缺陷型细胞sh BCN1-MDBK内,病毒增殖明显受到抑制(P0.05)。说明BVDV感染诱导的自噬促进了CP和NCP BVDV的复制。Ⅴ.BVDV诱导的自噬对细胞凋亡和IFN-Ⅰ表达的影响为了解BVDV诱导的自噬对细胞凋亡和IFN-Ⅰ信号分子有什么样的影响,CP和NCP BVDV分别感染自噬缺陷型MDBK细胞以后,发现与对照组相比sh BCN1-MDBK细胞存活率明显下降,尤其CP BVDV作用组在感染72h后更显著(P0.05);应用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡结果表明,BVDV HJ-1和NY-1感染sh BCN1-MDBK细胞组,与感染control-MDBK细胞组相比,细胞凋亡水平均增加,在72 h以后BVDV HJ-1感染组更显著(P0.05);应用RT-q PCR对IFN-α、IFN-β、Mx1和OAS-1分子m RNA水平进行定量,结果自噬缺陷细胞组与对照组相比BVDV HJ-1和NY-1显著上调了上述IFN-Ⅰ表达。以上实验结果表明BVDV-b亚型是黑龙江省主要流行株,其CP和NCP生物型均能诱导完整的自噬潮,细胞自噬能促进BVDV的复制,促进细胞的存活,抑制细胞凋亡和IFN-I表达,从而有利于宿主建立持续感染。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65

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