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《吉林大学》 2017年
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抗LOX-1基因工程抗体的分子设计、制备及其生物学活性研究

胡伟  
【摘要】:动脉粥样硬化类疾病是威胁人类健康的一大隐患。凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1;LOX-1)在动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥了重要的作用。正常情况下,LOX-1在体内的表达量很少,随着疾病的发展和病情的恶化,LOX-1的表达量急剧增加。研究表明LOX-1可以作为动脉粥样硬化类疾病的诊断分子和治疗靶标。目前,很多研究已经证明抗LOX-1单克隆抗体可以有效抑制或延缓动脉粥样硬化的发展和恶化,而且抗LOX-1单克隆抗体也可以作为动脉粥样硬化治疗试剂和显像分子的靶向传递载体。但是,由于单克隆抗体具有制备成本高;免疫原性大;其可结晶片段结构域与细胞表面受体结合影响抗体分子在血液中的流通以及向病灶组织的转移效率等诸多缺陷,因此抗LOX-1单克隆抗体在医药领域以及临床研究中的广泛应用受到限制。随着生物技术和抗体工程的发展,小分子抗体包括单域抗体,单链抗体等应运而生,这些抗体片段由于分子量小、免疫原性小、易于制备、可改造性强等优点,越来越多地被应用于药物研究中。然而,小分子抗体也有无法避免的缺陷。以单链抗体为例,由于单链抗体为单价,其抗原亲和力与完整的抗体分子相比有所降低,另外,由于缺少了可结晶片段结构域,其在血清中的半衰期也会缩短,这些都将影响单链抗体在医学应用中的效率。所幸,由于小分子抗体片段具有可改造性强,易于制备等优点,多种优化策略可应用于小分子抗体的进化。基于抗LOX-1单克隆抗体在动脉粥样硬化类疾病的诊断和治疗中的应用研究现状,性质优良的抗LOX-1单链抗体具有很大潜力成为新一代抗LOX-1单克隆抗体的有效替代物,在动脉粥样硬化的早期诊断和靶向治疗中发挥重要的作用。因此,本文以抗LOX-1单链抗体为基础,以开发抗LOX-1单链抗体高效生产工艺,制备高活性抗LOX-1单链抗体突变体或衍生物,以及研制以抗LOX-1单链抗体为载体的动脉粥样硬化靶向治疗药物为目的,为动脉粥样硬化类疾病的早期诊断和靶向治疗助力。本论文主要分为以下三个方面的研究:1.抗LOX-1单链抗体的制备工艺研究。这一部分内容主要研究了抗LOX-1单链抗体在大肠杆菌和短小芽孢杆菌两个原核表达系统中的表达情况;并利用响应面方法对单链抗体在短小芽孢杆菌中的表达条件进行了系统的优化;最后通过两步柱层析,获得了高纯度的单链抗体蛋白。此外,比较了利用两个原核表达系统制备的抗LOX-1单链抗体的性质特征,包括抗原亲和性,稳定性,结构特征等。研究结果表明抗LOX-1单链抗体在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,而在短小芽孢杆菌表达体系中得到了高效的可溶性表达,此单链抗体拥有和真核表达体系所得的单链抗体相似的抗原结合活性(1.017E-07 M)。这一部分内容不但奠定了本论文研究的基础,也为单链抗体的高效制备提供了可靠有效的参考信息。2.抗LOX-1单链抗体的工程改造。在这一部分内容中,利用三种不同的抗体进化策略对抗LOX-1单链抗体进行了系统的工程改造,以期获得高活性的单链抗体突变体或衍生物:(1)利用多聚化策略构建抗LOX-1单链抗体多聚体,以达到提高单链抗体的抗原结合效价的目的。通过缩短单链抗体重链结构域和轻链结构域间连接肽的长度以及将单链抗体片段与自聚化结构域融合的方法构建了一系列抗LOX-1单链抗体多聚体。经优化后,这些多聚体在短小芽孢杆菌中获得了较好的可溶性表达。研究结果表明,与抗LOX-1单链抗体单体相比,单链抗体多聚体的抗原结合活性以及抗体中和活性均有显著提高,尤其是单链抗体四聚体,其抗原结合效价提高近170倍,热稳定性和血清稳定性也有一定程度的提高。(2)在分子动力学模拟的辅助下,构建抗LOX-1单链抗体与LOX-1结合多肽的融合蛋白,以提高融合蛋白的抗原结合能力。分子动力学模拟表明,三个LOX-1结合多肽LTPATAI,FQTPPQL以及LSIPPKA和抗LOX-1单链抗体与抗原结合表位不同,因此将两者结合,有可能会提高整个融合分子的抗原结合活性。将LOX-1结合多肽分别融合在抗LOX-1单链抗体的N-末端,C-末端以及连接肽区域,构建了9株抗LOX-1单链抗体与LOX-1结合多肽融合蛋白。研究结果表明,多肽的序列及其与单链抗体融合位置的不同,直接影响了融合蛋白的抗原结合活性和稳定性。其中融合蛋白LSI-scFv,在没有显著影响热稳定性和血清稳定性前提下,抗原结合活性提高了近7倍。(3)计算机辅助的抗LOX-1单链抗体的体外突变。抗LOX-1单链抗体与LOX-1蛋白对接复合物的分析表明,抗LOX-1单链抗体30个氨基酸位点的改变可能会提高其与LOX-1的结合活性。因此,本研究构建了30株单链抗体突变体,并对30株突变体进行了表达和纯化。通过抗原结合活性分析表明,与野生型抗LOX-1单链抗体相比,突变体L102R,L103H,L103W,G104R和V190H与抗原的结合活性显著提高,其中突变体L103H的抗原结合活性提高近30倍。3.抗LOX-1单链抗体在动脉粥样硬化靶向给药系统中的应用初探。在动脉粥样硬化的治疗中,很多药物因为特异性差对正常组织造成了严重的副作用而被限制应用。在这一部分研究中,以抗LOX-1单链抗体或其突变体为靶向传递载体,装载具有动脉粥样硬化治疗效果的生物活性多肽包括抗氧化多肽,具有抗凝作用的水蛭肽,凝血酶抑制多肽,血管紧张素转化酶抑制多肽等。构建了一系列单链抗体和生物活性多肽融合抗体药物,并对融合抗体药物的抗原靶向能力、药效活性、立体结构特征等性质进行了鉴定。系统阐释了抗体片段与药物多肽结合在一起之后,两者对彼此性质的影响。最终获得了既保持了较好的抗原结合活性又具有相应药效活性的单链抗体和药物多肽融合抗体分子。综上所述,本研究建立了抗LOX-1单链抗体的高效制备工艺;并从不同视角,应用不同技术策略研究了抗LOX-1单链抗体的工程进化,获得了性质优良的单链抗体多聚体,单链抗体和多肽融合蛋白以及单链抗体突变体;最后,以抗LOX-1单链抗体及其突变体为载体,装载具有动脉粥样硬化治疗性生物活性多肽,构建了具有LOX-1靶向性和抗AS活性的双功能抗体-药物复合物。本论文不但为动脉粥样硬化的诊断和靶向治疗提供了材料支持,也为抗体片段的制备,工程进化以及其在靶向给药系统中的应用提供了有价值的参考信息。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R392;Q78

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