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CTLA-4 mRNA 3'UTR靶向性脱氧寡核苷酸的疫苗佐剂效应

李鑫  
【摘要】:细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)是表达在活化T细胞表面的一种重要的免疫抑制性分子。T细胞活化需要两个信号:抗原提呈细胞(APCs)表面MHC分子提呈的抗原肽与T细胞表面的T细胞受体(TCR)相互作用产生T细胞活化的第一信号;APCs表面的CD80或CD86与T细胞表面的CD28相互作用产生T细胞活化的第二信号。CTLA-4可通过与T细胞表面的CD28竞争结合APCs表面的CD80或CD86对T细胞活化发挥抑制作用。因此,抑制CTLA-4介导的免疫抑制性信号,可以促进T细胞活化,从而增强T细胞依赖的抗体应答,使CTLA-4抑制剂发挥疫苗佐剂效应。基于此,本研究设计并筛选了靶向CTLA-4 mRNA 3’非编码区(3’UTR)的单链脱氧寡核苷酸(ODNs),以此抑制CD4~+T细胞表面CTLA-4的表达水平,并确定其作用机制及对抗体应答的促进作用,为新型疫苗佐剂的研究提供了一个新策略。中文摘要CTLA-4 mRNA 3’UTR靶向性脱氧寡核苷酸的疫苗佐剂效应T细胞活化在T细胞依赖的抗体应答中发挥着重要作用,而细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)是表达在活化T细胞表面的一种重要的抑制性分子,可以与T细胞表面的CD28竞争结合抗原提呈细胞(APCs)表面的CD80或CD86,从而抑制T细胞活化。因此,阻断CTLA-4介导的免疫抑制性信号,可以促进T细胞的活化,从而增强T细胞依赖的抗体应答。本研究以人和小鼠CTLA-4 mRNA 3’非翻译区(3’UTR)的保守序列为靶点,设计了两个CTLA-4mRNA 3’UTR靶向性脱氧寡核苷酸(ODNs),CMD-1和CMD-2,并对这两个ODNs对CTLA-4表达的抑制作用及增强抗体应答的疫苗佐剂效应进行了研究,结果如下:1.CTLA-4 mRNA 3’UTR靶向性ODN的设计、筛选及鉴定为了获得CTLA-4 mRNA 3’UTR靶向性ODNs,我们通过网络数据库和生物信息软件,以人和小鼠CTLA-4 mRNA 3’UTR的保守序列为靶点,设计了一系列CTLA-4 mRNA 3’UTR候选靶向性ODNs,并通过生物信息软件对ODNs二级结构、自由能及靶点序列的二级结构等进行了分析,初步筛选并合成了两个ODNs,分别命名为CMD-1和CMD-2。结果显示,CMD-1和CMD-2形成分子间或分子内二级结构所需的自由能较高,而与靶区mRNA结合所需的自由能较低,并且不易非特异性地结合其他与CTLA-4无关的mRNA。由此可见,从理论上看,CMD-1和CMD-2相对不易形成分子间或分子内二级结构,易与靶区mRNA结合,并且具有良好的特异性。2.CTLA-4 mRNA 3’UTR靶向性ODN对CTLA-4抑制作用的研究为了研究CTLA-4 mRNA 3’UTR靶向性ODN对CTLA-4的抑制作用,我们首先对ODNs进入靶细胞的动力学进行了分析,然后分别采用流式细胞术和实时定量PCR(RT-PCR)法分析了ODNs对CTLA-4蛋白质及mRNA水平的影响,并对其作用机制进行了探讨。2.1 CMD-1及CMD-2进入靶细胞的动力学分析由于CTLA-4主要在CD4~+T细胞上发挥在生物学功能,因此,我们采用荧光标记的CMD-1和CMD-2,以体外和体内示踪的方法检测了两种ODNs进入CD4~+T细胞的情况。结果显示:1)CMD-1和CMD-2能以相似的效率进入体外培养淋巴结细胞中的CD4~+T细胞,并随着孵育时间的延长,CMD-1或CMD-2进入CD4~+T细胞的比例逐渐增加;2)CMD-1和CMD-2在CD4~+T细胞中的分布情况相似;3)当以肌肉注射的给药方式注射于na?ve ICR小鼠的右后肢时,CMD-1和CMD-2主要分布在注射部位同侧的腘窝淋巴结,在注射6、12及24 h后,注射部位同侧腘窝淋巴结的CD4~+T中均可以检测到CMD-1或CMD-2。以上结果提示,CMD-1和CMD-2可以进入CD4~+T细胞,这为ODNs在体内发挥作用提供了可能。2.2 CMD-1及CMD-2对CTLA-4表达的抑制作用为了研究CMD-1和CMD-2在进入CD4~+T细胞后是否可以对CTLA-4的表达发挥抑制作用,我们用重组Cp蛋白刺激Cp蛋白免疫小鼠的脾细胞,使T细胞活化,诱导小鼠CTLA-4的表达,在刺激细胞的过程中加入CMD-1或CMD-2,检测CMD-1或CMD-2对小鼠CD4~+T表面CTLA-4表达水平的影响。结果显示,CMD-1可以显著降低小鼠CD4~+T细胞表面CTLA-4的表达水平,而CMD-2对CTLA-4的表达没有显著抑制作用。为了进一步检测CMD-1和CMD-2是否可以抑制人CD4~+T细胞表面CTLA-4的表达,我们用佛波酯(PMA)和离子霉素(IONO)刺激人外周血细胞,使其中的T细胞活化,诱导CTLA-4的表达,同时加入CMD-1或CMD-2,检测CMD-1或CMD-2对人CD4~+T细胞表面CTLA-4表达的影响。结果显示,CMD-1和CMD-2均能显著降低人CD4~+T细胞表面CTLA-4的表达水平;尽管两种ODNs对CTLA-4的抑制作用没有统计学差异,但用CMD-1处理的CD4~+T细胞表面表达CTLA-4百分率的平均值要低于CMD-2处理的细胞。以上结果提示,CMD-1对人和小鼠CD4~+T细胞表面CTLA-4的表达均有显著抑制作用,这不仅使我们可以在小鼠模型上研究CMD-1是否可以通过抑制CTLA-4的免疫抑制信号而发挥佐剂效应,也使CMD-1有应用于人的潜力。2.3 CMD-1及CMD-2对CTLA-4 mRNA的作用为了验证CMD-1对CTLA-4的抑制作用是否是通过干扰CTLA-4 mRNA实现的,我们检测了CMD-1和CMD-2在细胞内对CTLA-4 mRNA水平的影响。结果显示,与CMD-2相比,CMD-1在细胞内可以有效下调CTLA-4 mRNA的水平,并且随着CMD-1被消耗,其对CTLA-4 mRNA的干扰作用逐渐消失,甚至可以出现负反馈上调。为了研究CMD-1干扰CTLA-4 mRNA的作用机制,我们通过体外转录的方法合成了CTLA-4 mRNA,然后将CMD-1或CMD-2与CTLA-4 mRNA共孵育,并在反应体系中加入RNase H,检测RNase H对mRNA的切割效率。结果显示,与CMD-2相比,CMD-1可以更好的与CTLA-4 mRNA结合,诱导RNase H对mRNA的切割。以上结果提示,CTLA-4 mRNA 3’UTR靶向性ODN CMD-1是一种有效的CTLA-4抑制剂,它可以进入CD4~+T细胞,通过与CTLA-4的mRNA结合,诱导RNase H对靶mRNA的切割降解,进而抑制小鼠或人CD4~+T细胞表面CTLA-4的表达。3.CTLA-4 mRNA 3’UTR靶向性ODN的疫苗佐剂效应研究为了研究CMD-1是否可以通过抑制T细胞的CTLA-4抑制性信号而发挥增强抗体应答的疫苗佐剂效应,我们检测了CMD-1对疫苗免疫小鼠后抗体水平和免疫细胞的影响,并探究了其作用机制。3.1 CMD-1对疫苗免疫小鼠血清抗体水平的影响为了研究CMD-1是否具有作为疫苗佐剂的潜能,我们将ODNs与灭活病毒疫苗或重组亚单位疫苗联用免疫小鼠,检测ODNs对抗体水平的影响;并且对小鼠品系、ODN剂型及ODN剂量对ODNs佐剂效应的影响进行了研究。结果显示:1)在与灭活口蹄疫病毒(FMDV)疫苗联用免疫小鼠时,CMD-1可以在免疫的第21天和第28天显著提高小鼠的血清抗体水平;2)在与重组CPAC VLPs疫苗联用免疫小鼠时,CMD-1在免疫的第14、21及28天均能显著提高小鼠的血清抗体水平;3)CMD-1不仅能在ICR小鼠中发挥佐剂效应,也可以在BALB/c小鼠中发挥佐剂效应;4)CMD-1的佐剂效应在一定程度上受到乳化剂的影响;5)CMD-1的疫苗佐剂效应有剂量依赖性,5μg/只或10μg/只的CMD-1均能显著上调免疫小鼠的血清抗体水平。3.2 CMD-1对疫苗免疫小鼠免疫细胞的影响为了探索CMD-1在体内对免疫细胞的影响,我们用ODNs和CPAC VLPs疫苗联用免疫小鼠,于第二次免疫后的48 h检测了小鼠的免疫同侧引流区淋巴结细胞和脾细胞中CD4~+T细胞、CD11c~+细胞及CD19~+B细胞的变化。结果显示,CMD-1在与疫苗联用免疫小鼠时,可以显著抑制CD4~+T细胞表面CTLA-4的表达,从而使CD4~+T细胞的比例及CD11c~+细胞表面CD80表达比例显著上调,但对CD19~+B细胞的影响不明显。3.3 CMD-1发挥佐剂效应的机制研究为了对CMD-1发挥疫苗佐剂效应的机制进行研究,我们通过利用Cp蛋白刺激Cp蛋白免疫小鼠的脾细胞的体外实验体系诱导T细胞活化,在刺激过程中加入ODNs,进一步检测ODNs对CD11c~+细胞表面CD80/CD86的表达、CD4~+T细胞和CD19~+B细胞的增殖活化能力及T_H2重要细胞因子IL-4的影响。结果显示,CMD-1可以通过抑制T细胞的CTLA-4免疫抑制性信号,促进CD4~+T细胞的增殖活化,进而促进CD11c~+细胞表面CD80及CD86的维持,上调IL-4的表达并促进B细胞的增殖活化。以上结果提示,CMD-1可以通过抑制T细胞的CTLA-4免疫抑制性信号,促进T细胞依赖的抗体应答,从而在灭活病毒疫苗和重组亚单位疫苗中发挥提高抗体水平的佐剂效应。综上所述,CMD-1可以作为一种新型疫苗佐剂,通过抑制T细胞的CTLA-4免疫抑制性信号而发挥增强抗体应答的作用,这种通过抑制免疫抑制性信号从而增强免疫应答的思路为疫苗佐剂的设计提供了一种新策略。


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