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《吉林大学》 2018年
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基于植物来源抗肿瘤化合物联合纳米载体的设计及其抗恶性肿瘤研究

王冠祎  
【摘要】:恶性肿瘤被认为是当今社会威胁人类健康的首要顽疾。恶性肿瘤可视为生长调节机制紊乱所致的异常组织增生,表现为高水平表达的癌基因和损伤修复系统来抵抗不利因素的攻击。恶性肿瘤危害人类健康的最大特点是高死亡率,绝大多数死亡与肿瘤的恶性转移相关联,多数临床肿瘤患者的死亡几乎源于转移性肿瘤。肿瘤的这些发病率多、隐蔽性强及致死率高的特点,使全世界发病现状不容乐观。随着全球人口不断增长与老龄化的加剧,癌症治疗已经引起了全世界人民的极大关注。植物来源的化合物因天然存在,资源丰富,生物学功能强大,并且对正常细胞毒性小,具有开发成天然抗肿瘤药物的潜能。植物来源的化合物往往受自身物化性质、药效和制剂等方面的局限性,妨碍了其应用于抗肿瘤治疗的领域。而纳米载体材料的出现恰能弥补植物来源的化合物存在的缺陷。此文以植物来源化合物姜黄素、染料木素为基础,联合纳米载体材料的设计用于抗恶性肿瘤的研究,并进一步探究其抗恶性肿瘤的分子生物学作用与意义。本论文的研究内容和主要结论如下:(1)骨肉瘤多发生于股骨远端和胫骨近端,发病特点是发病率高,常发病于青少年人群。骨肉瘤的患者治愈率不高,大多数患者最终死于肺部恶性转移。骨肉瘤143B细胞被发现是一种高致瘤和转移性的人源骨肉瘤细胞系,注射骨肉瘤143B细胞的小鼠肺部出现转移的数量比注射骨肉瘤MNNG/HOS细胞的小鼠高近50倍。而姜黄素(Cur)这种从植物姜黄根茎中提取的多酚类化学成分被证实无毒副作用,具有广泛的分子生物学功能来抑制不同类型的肿瘤细胞,但溶解度低、理化不稳定、生物利用度低、代谢快、药代动力学差的这些物化性质严重阻碍了姜黄素的临床应用。本研究采用聚乙二醇-聚(d,l-丙交酯-乙交酯)/聚(ε-己内酯)(m PEG-PLGA/PCL)的混合体系,制备了包覆姜黄素的聚合物纳米粒子Cur-NPs。DLS测得流体力学半径(Rh)为66.8 nm,通过TEM电镜测得姜黄素纳米粒子Cur-NPs在溶液中成球形;载药量(DLC%)和包封率(DLE%)分别为7.3%和72.8%。姜黄素纳米粒子Cur-NPs具有较低的临界聚合浓度(1.686×10-3mg/ml)和缓释释放行为,并有效地解决了姜黄素自身疏水性和不稳定性的局限性。游离姜黄素和姜黄素纳米粒子Cur-NPs对143B细胞在24h的半数抑制浓度(IC50)分别为21.3和16.8μmol/l,在48h的IC50分别为17.9和13.1μmol/l,姜黄素纳米粒子Cur-NPs对骨肉瘤143B细胞的增殖抑制作用明显优于游离姜黄素。143B细胞通过内吞途径对Cur-NPs的摄取效率高于通过被动扩散途径对游离姜黄素的摄取效率。在集落形成抑制实验中,20μmol/l游离姜黄素和Cur-NPs(相同姜黄素当量)均能明显阻碍集落的形成。同游离小分子姜黄素相比,姜黄素纳米粒子Cur-NPs对143B细胞的迁移和侵袭抑制作用更加突出。Cur-NPs处理诱导的晚期凋亡细胞比例略多于游离姜黄素(23.7%vs.20.7%),早期凋亡细胞比例分别为25.4%(姜黄素)和21.0%(姜黄素纳米粒子Cur-NPs),证实Cur-NPs能诱发强烈的细胞凋亡。结果还发现,姜黄素和Cur-NPs均能降低癌基因c-Myc和基质金属蛋白酶MMP7在m RNA和蛋白水平的表达,从而解释了其抑制转移性骨肉瘤143B细胞增殖、迁移和侵袭的机制,为转移性骨肉瘤的治疗提供了理论基础和实验借鉴。(2)前列腺癌被认为是一种典型的男性恶性肿瘤。美国癌症协会发布的2018年癌症统计显示前列腺癌是男性总发病率和死亡率前三的癌症类型之一。前列腺癌的治疗仍具有挑战性,大多数前列腺癌患者死于肿瘤转移,因为恶性前列腺癌细胞的转移能够从原发灶到转移灶直肠、膀胱、骨、淋巴结、肺和肝脏。盐酸阿霉素(DOX·HCl)被认为是治疗前列腺癌最有效的药物之一,但其治疗后会导致严重的副作用和出现肿瘤转移的问题。本研究基于植物来源化合物染料木素(GEN),与利用载体材料聚(乙二醇)-b-聚(L-谷氨酸-co-L-苯丙氨酸)(m PEG-b-P(Glu-co-Phe)构建的阿霉素纳米粒子DOX-NPs共给药系统用于恶性前列腺癌细胞RM-1的治疗,通过放大氧化损伤来阻碍前列腺癌细胞的远距离转移。首先,两亲性氨基酸无规共聚物m PEG-b-P(Glu-co-Phe)负载游离DOX·HCl所制备的纳米粒子DOX-NPs的载药量(DLC%)和包封率(DLE%)分别为6.71%和67.1%,在水溶液中水动力半径约为74.0nm。其次,MTT细胞毒性实验中,DOX·HCl和DOX-NPs的IC50在24h分别为0.647μM和0.451μM,IC70在48 h分别为0.756μM和0.559μM,表明DOX-NPs对RM-1细胞的杀伤作用略高于游离DOX·HCl。细胞摄取实验验证,同小分子游离DOX·HCl相比,纳米粒子DOX-NPs可以更好地被细胞摄取。更重要的是,在肿瘤组织中过度表达的关键酶脱嘌呤/脱嘧啶内切酶1(APE1)负责DNA氧化损伤引起的DNA修复,是前列腺癌治疗的障碍。通过在m RNA水平上的分析,细胞内ROS和细胞凋亡测试证实,染料木素能够在时间和浓度依赖下降低APE1表达,随GEN浓度升高诱导产生更多ROS和增加凋亡细胞比例。最后,根据组织ROS检测,肿瘤抑制,组织分布,病理切片以及免疫组化分析实验,得出结论:染料木素与阿霉素纳米粒子的联合使用可以降低游离DOX·HCl的全身毒性,可以改善肿瘤的蓄积;另一方面,DOX-NPs提高胞内ROS水平,产生氧化损伤。同时,利用GEN作为DOX-NPs的辅助用药,可以下调APE1的表达,提高细胞内的ROS水平和扩大氧化损伤。DOX-NPs和染料木素的联合应用可明显抑制前列腺癌的恶性转移,为阻止肿瘤转移提供良好的策略选择。通过本论文的实验研究,希望可以对植物来源抗肿瘤化合物的研发提供基础性科研依据,同时为其联合纳米载体的设计和研究提供参考和新想法,为更多植物来源抗肿瘤化合物的临床应用奠定基础。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R943;R96

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【参考文献】
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【共引文献】
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【二级参考文献】
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