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《吉林大学》 2018年
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新城疫病毒感染鸡巨噬细胞miRNA表达谱分析及gga-miRNA155的功能

陈严玉  
【摘要】:新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)强毒株引起的一种禽类急性高度接触性病毒性传染病,可感染大部分的非免疫鸟类,并可跨种传播哺乳动物。我国当前的优势型新城疫毒株为基因VII型强毒,其高致死率对全球养禽业的经济造成了严重危害。而现阶段对新城疫的防控措施主要依赖疫苗接种,在一定程度上控制了禽类感染新城疫病毒后的临床症状以及死亡现象,却无法完全控制病毒在禽类体内的复制以及机体向体外排毒的现象,因此单纯的依赖疫苗免疫存在着一定的局限性。microRNA(miRNA)是一类长度为18~25 nt的可以由动物、植物、病毒等多种生物体编码合成的非编码小RNA,参与组织发育、细胞分化、增殖凋亡,以及在调控病毒的基因表达、干扰病毒复制、组装、释放等环节都发挥着重要的作用。本文通过高通量技术分析了鸡巨噬细胞感染新城疫强、弱毒后的miRNA表达谱,对筛选后的众多差异miRNA的表达量进行了荧光定量鉴定,并利用软件对差异miRNA进行了功能性分析,为今后研究新城疫病毒与miRNA之间的相互作用奠定了一定的基础。根据相关的文献和实验结果以及这次的高通量数据,选取了miRNA155作为研究对象,研究其在新城疫病毒感染鸡巨噬细胞过程中对病毒在细胞中复制的作用,并利用相关软件对miRNA155的靶基因和功能进行了预测和分析。研究分为以下几个部分:1.新城疫病毒感染鸡巨噬细胞后的miRNA表达谱分析用MOI=2剂量的新城疫强(NA-1)、弱(La Sota)毒株分别感染鸡巨噬细胞(HD11),在感染后24 h、48 h分别收集细胞,并设立空白对照组。用Tripure提取总RNA,对总RNA进行质量检测评估,选取质量合格的样品进行高通量测序。对不同毒株在同一时间点以及同一毒株在不同时间点感染细胞后的mi RNA表达谱进行分析(p value0.01,信号值100,差异值|Log2|2),为下一步鉴定差异miRNA做准备。结果显示NA-1毒株感染HD11细胞24 h后产生了2227种miRNA,感染48 h后产生了1954种miRNA。La Sota毒株感染HD11细胞24h后产生了1950种miRNA,感染48 h后产生了1914种miRNA。2.差异miRNA的表达量分析比对感染组样品与未感染组样品细胞内的mi RNA,对差异miRNA进行筛选和分析。发现与未感染组相比感染NA-1的细胞在24 h和48 h分别产生了233和263种差异miRNA,有122个miRNA是在24 h和48 h都持续产生的。而感染La sota后在24 h和48 h分别产生了158和153种差异miRNA,其中有35个miRNA是在感染后24 h和48 h都持续产生的。另外有18个mi RNA是在不同毒株以及不同时间点感染后都持续存在的。用Tripure提取感染了MOI=2的NA-1和La sota在24 h和48 h的HD11细胞的总RNA,并用miRNA反转录试剂盒对总RNA进行反转录获得cDNA,运用荧光定量染料法以cDNA为模板对筛选后的差异miRNA进行进一步的筛选鉴定。实验结果表明,Q-PCR后在17个差异miRNA中有2个miRNA的表达量在感染前后有显著差异,且表达量均上调,通过GO和KEGG分析对其生物学功能进行预测和分析。3.miRNA155对新城疫病毒在鸡巨噬细胞内复制水平的影响分别用不同剂量的NA-1毒株感染HD11细胞,并分别在24 h、48 h提取总RNA,并用miRNA反转录试剂盒对总RNA进行反转录获得cDNA,运用荧光定量以cDNA为模板分别检测HD11细胞感染不同剂量的NA-1毒株时在不同的时间点的细胞内miRNA155的表达量与病毒含量。对HD11细胞转染miRNA155的模拟物(mimic)、抑制剂(inhibitor)模拟miRNA155的过表达以及功能抑制现象,观察新城疫病毒感染后病变现象,并对miRNA155的表达量、病毒含量以及相关细胞因子进行检测。利用Targetscan和miRDB软件对miRNA155的靶基因进行预测并进行了相关验证和分析,进一步探索miRNA155对新城疫病毒在HD11细胞内复制水平的影响。实验结果显示,HD11细胞转染了miRNA155的模拟物和抑制剂后感染新城疫病毒不发生病变现象,但是病毒含量并没有发生变化,而某些相关细胞因子的表达量发生了显著变化。并且miRNA155能够引起TAB2靶基因的表达量的显著上升,而TAB2与p38MAPK通路有关。这说明miRNA155参与病毒感染引起的炎症反应,并且可能参与了TAB2所在的p38MAPK通路,并通过通过一系列的反应影响了细胞的病变现象或者病毒的组装和出芽,但是miRNA155不能直接影响新城疫病毒在HD11细胞内的复制。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S858.31

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