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《吉林大学》 2018年
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Lhx8通过Arx调控新生大鼠海马神经元的发育

孙迪  
【摘要】:目的:探究Lhx8调控新生大鼠胆碱能神经元和GABA能神经元的作用机制,为深入阐明阿尔兹海默症、血管性痴呆、抑郁症、癫痫等神经系统疾病提供依据。方法:结合生物信息学软件的预测,设计与Lhx8蛋白结合的Arx寡核苷酸探针,人工合成双链,使用生物素对探针进行3,的标记,进行EMSA实验检测转录调控因子Lhx8是否可以与Arx基因结合。空载体质粒,命名为Lenti-CON(p LVX-Tight-IRES-Zs Green-Neo);将r Lhx8 c DNA链接入p LVX-Tight-IRES-Zs GreenNeo质粒产生Lhx8过表达慢病毒载体质粒,命名为Lenti-Lhx8(p LVX-Tight-r L hx8-IRES-Zs Green-Neo);将Arx sh RNA基因片段,两端加上限制性内切酶Ba m H I,链接入p LVX-Tight-IRES-Zs Green-Neo质粒产生干扰Arx基因表达的慢病毒载体质粒,命名为Lenti-Arx sh RNA(p LVX-Tight-Arxsh RNA-IRES-Z s Green-Neo);Arx sh RNA基因片段链接入p LVX-Tight-r Lhx8-IRES-Zs Green-Neo质粒产生Lhx8过表达同时干扰Arx基因表达的慢病毒载体质粒,命名为LentiLhx8/Arx sh RNA(p LVX-Tight-r Lhx8-Arxsh RNA-IRES-Zs Green-Neo)。将载体质粒、包装质粒p LP1、p LP2、p LP/VSVG及Tet-on调控质粒共转染293T细胞,包装出慢病毒。使用Lenti-CON、Lenti-Lhx8、Lenti-Arx sh RNA及Lenti-Lh x8/Arx sh RNA四种慢病毒,对新生大鼠进行侧脑室定位注射,腹腔注射强力霉素2.7mg/kg(Doxitard,DOX),诱导搭载Tet-on系统的慢病毒载体质粒中Lhx8基因和/或Arx小干扰RNA表达。侧脑室注射48h、72h及96h后,提取鼠的左侧海马RNA进行RT-PCR,提取鼠的右侧海马总蛋白进行Western blot,取鼠全脑制作石蜡切片。通过这些技术检测Arx、Lhx8以及胆碱能神经元表面阳性标记物(Choline Acetyltransferase,CHAT)与GABA能神经元表面阳性标记物GAD65(Glutamic Acid Decarboxylases 65,GAD65)的m RNA和蛋白表达变化。结果:1、EMSA实验显示Lhx8蛋白可以与Arx DNA探针结合;2、将Lhx8 c DNA与Arx发夹环构建于同一载体,可以有效实现Lhx8基因过表达及Arx基因的低表达;3、成功包装慢病毒载体Lenti-CON、Lenti-Lhx8、Lenti-Arx sh RNA及Lenti-Lhx8/Arx sh RNA,经浓缩纯化后感染效率良好;4、注射慢病毒48h时,RT-PCR、Western Blot及免疫荧光结果显示,各项指标各组之间无差异。5、注射慢病毒72h及96h时,RT-PCR结果显示,过表达Lhx8使Arx m RNA表达减少,过表达Lhx8使CHAT m RNA表达增加,使GAD65 m RNA表达减少;干扰Arx对CHAT m RNA表达没有影响,但使GAD65 m RNA表达减少;过表达Lhx8组与过表达Lhx8同时干扰Arx组相比,GAD65 m RNA表达没有差异。Western Blot及免疫荧光结果显示,过表达Lhx8使CHAT蛋白表达增加,使GAD65蛋白表达减少;干扰Arx使GAD65蛋白表达减少。结论:Lhx8作为转录调控因子,可以与Arx基因结合,抑制Arx基因的表达;Lhx8基因过表达能够促进新生大鼠海马区胆碱能神经元的分化,抑制GABA能神经元的分化;Arx基因对新生大鼠海马区GABA能神经元的分化有正向调控的作用,对胆碱能神经元的分化无影响。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q42

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
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【共引文献】
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