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《吉林大学》 2018年
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CRISPR-Cas9导向RNA对人抑癌基因p53与PTEN的编辑靶点筛选与效率验证

许文舒  
【摘要】:背景与目的:肿瘤一直以来都是威胁人类健康和缩短人类寿命的一类重要原因。近年来,随着临床医学的进步,越来越多的肿瘤治疗方法不断问世,每一种治疗方法在应用于临床之前都需要有大量的动物实验进行验证以确保其有效性及安全性。早期的动物肿瘤模型构建主要通过理化因素诱发,与人类肿瘤的发生和发展过程有较大差异。所以当下更多研究的是通过生物技术手段移植原代肿瘤细胞或诱导细胞内基因突变使实验动物患病的方法。本研究的探讨应用新兴基因编辑技术规律性成簇的间隔短回文重复序列-核酸酶系统(CRISPR-Cas9)对人体内至关重要的2个抑癌基因p53与PTEN进行编辑的可行性,并通过体外检测研究其编辑效果,为原代细胞向肿瘤细胞转化及建立人源化小鼠肿瘤模型提供实验研究工具。方法:通过序列分析确定p53及PTEN基因各亚型m RNA剪辑的共同外显子区域,针对该区域进行软件评分,设计选择针对p53及PTEN基因的CRISPR-Cas9导向RNA(sgRNA)靶点各2个:p53-1、p53-2、PTEN-1和PTEN-2。构建共表达sgRNA与Cas9-P2A-GFP的CRISPR-Cas9质粒。选择处于对数生长期的293T细胞,将其分为对照组(未转染质粒的野生型293T细胞)和实验组(利用Lipo-fectamine2000转染sgRNA-Cas9-P2A-GFP共表达质粒的293T细胞),流式细胞分选实验组绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞(成功转染质粒的细胞),2周扩增培养后提取基因组DNA,PCR扩增基因组DNA包含突变位点的区段,将扩增产物凝胶电泳后胶回收,连接至pEASY-Blunt Zero克隆载体中,转化,挑取单克隆菌斑培养,提取质粒DNA测序,对比对照组与实验组测序结果后确定RNA介导的特异基因位点突变效率。结果:转染sgRNA-Cas9-P2A-GFP质粒的实验组流式细胞术分选后GFP阳性率高达82%,与分选前(4%)比较明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。对分选培养后的细胞提取基因组PCR位点的扩增序列,比对实验组基因测序结果与未经sgRNA-Cas9-P2A-GFP质粒转染的对照组野生型细胞测序结果,p53-1、p53-2和PTEN-2诱导的突变效率分别为54.5%,45.5%和33.3%。结论:针对人p53及PTEN基因设计的sgRNA p53-1、p53-2和PTEN-2能够在基因组水平较高效率地成功介导Cas9进行位点特异性的基因编辑。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q78;R73

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【参考文献】
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【共引文献】
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【二级参考文献】
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