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《吉林大学》 2019年
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艾滋病分支肽疫苗的临床前免疫原性评价及rAAV8介导HIV-1广谱中和抗体的构建与包装

姜晓宇  
【摘要】:艾滋病是一种致死率极高的重大传染类疾病,病因是感染了人类免疫缺陷病毒(HIV),因其感染蔓延范围广、病毒传播速度快等特点,对人类健康有着极为严重的影响。当前对艾滋病的治疗方式主要是从尽可能降低HIV病毒载量和对患者自身的免疫功能进行重建及维持这两个方面进行研究。目前可以实现最大限度降低患者体内病毒载量的疗法就是鸡尾酒疗法,但该疗法极易产生耐药、有较大副作用、仍有较高的病死率等诸多缺点。因而,一直以来疫苗都是研究人员防治艾滋病的重点研究方向。研究人员从艾滋病感染者中的精英控制者体内分离出数百种具有交叉保护活性的广谱中和抗体。广谱中和抗体可以中和多种型别的艾滋病病毒,清除游离的病毒或是已被感染病毒的细胞。因而广谱中和抗体能有效抑制病毒,并控制艾滋病的发展。因此,对广谱中和抗体进行深入研究是今后开发艾滋病疫苗的重要方向之一。通过主动免疫疗法或被动免疫疗法来促使机体中的广谱中和抗体处于较高水平,是目前设计开发艾滋病疫苗的重要策略。第一部分:艾滋病分支肽疫苗的临床前免疫原性评价课题组前期研究筛选并确定了基于HIV-1 MPER的线性表位4E10,搭载四分支肽载体设计免疫原,辅以油佐剂,4E10-MAP_4免疫原在豚鼠体内诱导出的结合抗体滴度可达1×10~4-1×10~5,并且诱导出的中和抗体对C型、BC型HIV-1分别为93%、73%的中和活性。然后在此基础上,通过对抗体结合活性的研究,制定以氢氧化铝为制剂处方佐剂、BALB/c小鼠和豚鼠分别为50μg/只和100μg/只的免疫剂量和间隔两周免疫一次、总共进行四次皮下免疫为较优免疫策略,滴度达1×10~4-1×10~5。基于以上进展,委托长春百克公司合成艾滋病4E10-MAP_4疫苗制剂,从长期稳定性及加速稳定性两方面检测制剂,验证了疫苗制剂符合药典要求,并确定了其有效期为2~8℃条件下36个月,及1个月内20~25℃和36±1℃条件下可保持外观及理化性质稳定的储存及运输条件。基于上述课题组已获得的研究成果,我们希望为4E10-MAP_4疫苗的临床前和临床试验奠定前期基础。因此,研究的主要内容是在将4E10-MAP_4分支肽疫苗制剂进行临床试验前,对制剂进行免疫原性评价,包括:血清转阳率、抗体效价、中和抗体活性、组织中抗体表达。通过检测食蟹猴和BALB/c小鼠血清中的结合抗体,实验动物的转阳率均超过80%,且诱导产生的结合抗体活性较高,部分个体的抗体效价可达2×10~5,疫苗免疫原性好。食蟹猴体内抗体具有一定的中和活性,但中和活性较低,血清以1:30比例稀释时,中和百分率最高为52%,ID_(50)30;而BALB/c小鼠的ID_(50)30,抗体中和活性较为微弱。同时研究了抗体在BALB/c小鼠组织中的分布,用分支肽疫苗制剂对BALB/c小鼠进行单次免疫,在免疫后1天、7天、21天时检测结合抗体在BALB/c小鼠血清及组织内分布。小鼠在部分组织如脾、肝等脏器中存在结合抗体。组织中的抗体可能会对病毒中和、激发免疫应答等方面发挥作用。因而,从以上几个方面完成对疫苗的临床前免疫原性评价。第二部分:rAAV8介导HIV-1广谱中和抗体的构建与包装广谱中和抗体10E8相比于同样作用于HIV-1 MPER的4E10抗体,中和能力更强,作用范围更广,在Huang,J.等人的研究中,10E8对选取测试的98%的病毒均有中和活性;广谱中和抗体NIH45-46可模拟CD4分子作用于HIV-1上的CD4结合位点,其重链第三互补决定区残基可增强与gp120分子的结合,抗体中和活性强;广谱中和抗体PG9具有环状结构,因其结构特异性能紧密结合HIV-1三聚体头部,作用于gp120的V1/V2区,具有较强的结合能力,抗体中和活性强。因此筛选出以上三种广谱中和抗体,并为促进机体积累高浓度的广谱中和抗体,我们从被动免疫疗法进行研究,以直接使机体接受抗体的方式提高体内抗体滴度。因腺相关病毒可介导外源基因的长效表达,且8型重组腺相关病毒在人类中预存免疫少。因此,本研究以rAAV8为载体,设计并成功构建出可以介导广谱中和抗体10E8、NIH45-46、PG9表达的表达质粒,成功包装并纯化出纯度较高的rAAV-10E8、rAAV-NIH45-46、rAAV-PG9、rAAV-RFP四种8型重组腺相关病毒。该部分为实现8型重组腺相关病毒介导HIV-1广谱中和抗体10E8、NIH45-46、PG9的产生奠定研究基础。后期将会利用所收取并纯化后的病毒感染细胞,探究抗体的体外表达。并采用单独免疫一种病毒、联合免疫两种病毒及联合免疫三种病毒的免疫策略,对BALB/c小鼠进行免疫,研究rAAV8介导抗体的体内表达。我们希望能获得以8型重组腺相关病毒介导可长效表达的抗艾滋病病毒的广谱中和抗体,为艾滋病被动免疫治疗方式的探索提供基础。这也将会为防治艾滋病,提出一种新的候选疫苗方案。综上,我们对基于主动免疫方式诱导广谱中和抗体而开发的4E10-MAP_4分支肽疫苗制剂进行了免疫效果分析,疫苗具有较好的免疫原性,在组织中检测出的结合抗体,为未来艾滋病治疗、降低组织中病毒载量、保护艾滋病患者等方面,提供了新的研究方向,为疫苗制剂提供了临床前试验的相关数据。同时,为了实现对抗HIV-1广谱中和抗体的诱导,完成以被动免疫方式介导中和抗体表达的8重组腺相关病毒的质粒构建与病毒包装,奠定介导HIV-1广谱中和抗体产生的研究基础,以期以被动免疫疗法开发艾滋病疫苗候选疫苗,为开发艾滋病候选疫苗提供参考。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R392

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