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《吉林大学》 2004年
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由CX32和CX43组成的缝隙连接在癫痫发病中的作用及调控机制的实验研究

蔡正旭  
【摘要】:癫痫是神经系统常见病,是多种病因导致的慢性脑疾患,其特点是大脑神经元反复地、过度地超同步化放电,引起一过性和发作性的脑功能障碍。癫痫患病率为0.46%,发病率为37/10万/年。癫痫是一种以药物治疗为主的疾病,随着医学科学的不断进步,药物治疗癫痫的总有效率已达65%以上,但仍有35%的癫痫对现有的药物治疗无效,成为难治性癫痫。目前,国内外许多实验都证实了癫痫与缝隙连接(GJ)有密切关联,但尚不弄清楚何种缝隙连接蛋白(CX)形成的GJ在癫痫活动中起主导作用。 目 的 本研究采用先进的实验手段,从分子水平探讨CX32和CX43在癫痫中变化,阐明何种CX形成的GJ在癫痫活动中起主要作用,为针对GJ发展新的抗癫痫药物确定靶点。合成特异性阻断GJ的连接蛋白拟似肽(CMP),并观察其作用, 以进一步针对该靶点的抗癫痫研究与治疗奠定基础。 方 法 雄性Wistar 大鼠250只, 正常对照组25只。手术对照组25只。KA致痫组200只,分别按3小时、6小时、12小时、24小时、72小时、7天、15天、30天时间点分为8组, 每组25只。以上各组又分三个小组,CMP组、甘珀酸(CAR)组、生理盐水组,每一个小组5只,进行脑电图描记(共150只)。剩余的100只按时间段分别进行Western blot及 WP=104 免疫组化分析。 致痫方法 将大鼠固定于立体定位仪上,取头颅正中菱形切口,暴露颅骨及前卤、后卤。右侧杏仁核基底外侧核的坐标位置为前囟后3.5 mm,中线右侧旁开4.5mm,硬脑膜下7.5mm。按上述右侧杏仁核坐标,注入海人藻酸(KA)1μl,对照组为PBS注射液1μl。 脑电描记方法 将大鼠头部固定在立体定位仪上,身体用胶带固定。取头颅正中纵向切口,暴露颅骨及前卤、后卤。用小型牙科钻,以前囟后2.5mm, 中线左侧旁开2.5 mm 为中心, 去除颅骨3 mm×3mm 范围, 除去硬脑膜, 暴露皮层感觉运动区。被暴露的皮层面用3 mm ×3mm大小的干净滤纸片盖住以此保持体温和湿度。在此处局部浸润各种药物。用A g-A gCl 乏极化电极作为引导电极,分别牙科水泥固定在额顶部及顶枕部,即暴露皮层的前后两端,硬膜下0.25 cm。无关电极安置于鼻尖部。电极接到日本产EEG-7209型脑电记录仪上。 麻醉1~1.5小时后开始记录脑电,以尽量减少麻醉药对脑电的影响。 用药方法 先预防用药(多肽组用CMP, 浓度为500μΜ;CAR组用甘珀酸钠,浓度为10mM; 生理盐水对照组用生理盐水,滴入到盖在皮层上的滤纸片上)记录基础脑电30分钟, 再给致痫剂4-AP(将药物结晶体放到盖在皮层上的滤纸片上, 直到脑电描记结束,以将其充分融解、浸润到皮层脑组织), 以引发痫性脑电的发放,连续描记1 小时。 3小时组的用药和脑电描记方法于其他时间段有所不同,此组描记脑电共一个小时,先未用任何药物的情况下记录基础脑电30分钟,而后用CMP、CAR及生理盐水(浓度同上),再描记脑电30分钟,其余同上。 主要观察潜伏期、出现第一个癫痫波开始15分钟内的癫痫波发放的总数、平均振幅和1小时内癫痫发作持续时间。 免疫组化方法 主要观察不同组别、不同脑区、不同时间段CX32和CX43阳性细胞的分布及表达数目。 Western blot方法 主要观察不同组别、不同脑区、不同时间段CX32和CX43的表达量的变化。 结 果 WP=105 1.所建立的KA致痫模型成功率为96.4%,均出现Racine 分级Ⅳ级以上发作及相应的癫痫波发放。 2. KA致痫后脑组织病理形态学观察: 早期以神经元变性为主并有少许神经细胞坏死。中期KA注射组的颞顶叶皮层及海马区病变进一步加重,不同程度的神经元脱失及胶质细胞增生和毛细血管增多的改变。后期主要以神经细胞脱失,胶质细胞及毛细血管增生为主的病变。以上改变均以海马CA1和CA3区表现得最为严重,齿状回改变不明现。 3. KA致痫大鼠CX32表达的变化 免疫组化法 正常海马各区及皮层CX32阳性细胞稀少,胞浆与胞膜着色。KA致痫后大鼠的大脑皮层及海马均有CX32阳性表达。KA致痫后3小时大鼠的海马各区及皮层CX32的表达迅速增多,第3天达高峰,后逐渐下降。到第30天时阳性细胞数仍多于对照组。KA致痫后各时间组CX32阳性表达的细胞数与对照组相比,差异有极显著性,P<0.01,手术对照组与正常对照组相比CX32阳性细胞数差异无显著性,P>0.05。皮层与海马相比CX32阳性细胞数差异有显著性,P<0.05。海马CA1、CA3及CA4区CX32阳性细胞数较多,其中CA3区表现明显,CA2和DG区变化不明现。 Western blot法 正常海马各区及皮层CX32表达量很少。KA致痫后大鼠的大脑皮层及海马均有CX32阳性表达。KA致痫后3小时大鼠的海马各区及皮层CX32的表达量迅速增多,第3天达高峰,后逐渐下降。到第30天时其表达量仍高于对照组。KA致痫后各时间组CX32表达量与对照组相比,差异有极显著性,P<0.01,手术对照组与正常对照组相比CX32表达量差异无显著性,P>0.05。皮层与海马相比CX32表达量差异有显著性,P<0.05。 4. KA致痫大鼠CX43表达的变化 免疫组化法 正常海马各区及皮层CX43阳性细胞稀少,胞浆与胞膜着色。KA致痫后大鼠的大脑皮层及海马均有CX43阳性表达。KA致痫后3小时大鼠的海马各区及皮层CX43阳性细胞数逐渐增多,时程越长 WP=106 阳性细胞数目越多。KA致痫后各时间组
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R742.1

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