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《吉林大学》 2004年 博士论文
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古细菌Aeropyrum pernix K1嗜热酶的催化活性和稳定性研究

王柏婧  
【摘要】:古细菌因其独特的基因类型、特殊的生理机制和特殊的代谢产物,使其在生命起源、系统进化等方面都给人们以重要启示,因而引起世界科学工作者的广泛关注。特别是嗜热古细菌,因为来自于它的嗜热酶不仅具有高热稳定性而且也具有较高的抗有机溶剂及变性剂的能力,因此,对嗜热菌的研究不仅具有重要的科学价值,而且还具有诱人的应用前景。本文所研究的超嗜热古细菌Aeropyrum pernix K1是目前为止发现的第一个超嗜热严格需氧古细菌,所以对来自于它的嗜热酶的研究将有更重要的意义。 磷脂酶A_2广泛存在植物体和哺乳动物体当中,目前,从蛇毒、蜂毒等体内已经提取出多种磷脂酶A_2,与这些真核生物相比,微生物来源的磷脂酶A_2的研究相对较少,目前,仅Sugiyama等人从原核的Strptomycesviolaceoruber中成功的克隆了一种新型的PLA_2。它们在体内脂类物质代谢以及信号转导等方面都具有重要作用。由于嗜热磷脂酶A_2在油脂脱胶领域中具有其他中温酶所无法取代的优越性,寻找一种能耐高温的酶就成为当前的热点。 通过网上基因序列搜索及生物信息学分析,选择了嗜热古细菌Aeropyrum pernix K1中的APE 2325作为研究对象,这是一个经过预测可以表达磷脂酶A_2的一段序列。通过对Aeropyrum pernix K1的培养,提取 吉林大学博士学位毕业论文作者:王柏靖 基因组DNA作为模板,采用PCR技术扩增目的基因后,与pET15b载体 相连接,然后转入大肠杆菌中进行表达。这是第一次从嗜热古细菌中成功 的克隆了能表达磷脂酶A:的基因。在纯化过程中,为了简化纯化步骤, 通过85℃热处理除去来自大肠杆菌的大部分杂蛋白,然后再采用镍亲和 柱层析的方法进行纯化。经SDS一PAGE电泳确定,其分子量为18KDa左右。 通过对纯化的重组酶APE 2325进行酶学性质研究结果表明:该酶既具有 磷脂酶A,活力又具有酷酶活力。二者发挥催化活力的最适温度均为90℃。 APE2325发挥酷酶作用的最适底物是对硝基苯酚丙酸酷。同时,该酶具有 较强的耐碱性和较高的热稳定性。在70℃保温60分钟酶活力几乎没有损 失,在80℃保温60分钟酶的残余活力为80%,在90℃保温60分钟酶的 残余活力为70%,在100℃保温60分钟酶的残余活力为46.69%。通过氨 基酸组成分析,该酶的疏水氨基酸含量(47.7%)及其带电荷的氨基酸总 量(32.5%)要远远高于其他的中温酶,说明该酶的热稳定性可能主要由 疏水键和离子键决定的;此外大量的Gly(n.25%)可能在结构的稳定 过程中也起到一定的作用。通过对硝基苯酚丙酸酷底物的动力学研究表 明,90oC时的Km,kcat,Vm分别为1 03 oM,39.045一‘,249.69 0 mol/mi川mg。 另外,lmM Na+对酷酶活力有部分抑制作用,而lmM zn2+则完全抑制 了酷酶活力。Ca2+对磷脂酶AZ活力没有明显的激活作用,所以该酶属于钙 不依赖型。 酷酶在动物、植物和微生物体体内也广泛分布,由于它们在水相和 非水有机溶剂中均有催化活性,因此酷酶被广泛应用于各种工业生产之 中,如手性化合物的合成、转酷化反应、油脂的特性改良和其他有机合成 中;嗜热酷酶因为在有机溶剂及变性剂中具有较高的抗性,因而在医药、 合成化学以及食品工业领域有着巨大的潜力。 超嗜热酷酶APE 1 547也来源于超嗜热古细菌Aer(¥少厂umperntx Kl, 经PCR克隆后,转入中温宿主大肠杆菌中进行大量表达。表达后的 APE1547保持了天然酶的良好的热稳定性及抗有机溶剂、变性剂的能力。 吉林大学博士学位毕业论文 作者:王柏靖 该酶经过晶体解析后,可以看出其由两个结构域所组成,即N端由7个 反p片层组成的推进器结构域和C端典型的a/p水解酶结构域。这两个 结构域之间除了以大量的非共价键作用之外,N末端还具有一个由21个 氨基酸构成的a螺旋手臂结构,该手臂结构与C端Q/p结构的其它3段 a螺旋(包括一段连接两个结构域a螺旋;一段C末端最后一个Q螺旋; 一段与处于结构内部最长的一条loop相连接的a螺旋)共同构成一个a 螺旋密集区,形成了一个与锁扣相类似的结构,其中手臂结构处于关键位 置,因此推测手臂结构对酶结构的稳定性以及活力调解具有重要的作用。 为了进一步研究手臂结构对超嗜热醋酶APE巧47结构的稳定性和活力的 作用,采用基因工程手段切去这个手臂63个碱基,获得突变体基因。突 变体基因在大肠杆菌BL一21(DE3) Codon Plus中大量表达,分别采用热变 性,HITrap Q Sepharose和Sephaery1S一 200进行分离纯化,得到突变 体蛋白。通过对野生型及突变体的酶学性质的比较,发现野生型的最适反 应温度为90℃,最适PH为8.0,而突变体的最适反应温度为75℃,最适 pH为8.5,并且突变体的pH适用范围更宽。从底物特异性来看,突变体 与野生型基本一致,最适底物均为对硝基苯酚辛酸醋。除Mn2+对两种酶有 部分抑制之外,只有Mg2+、Li‘和Ba2+对突变体有轻微的抑制作用,而对 野生型没有影响。Sr‘、Ba2+、Zn2+和K+对野生型有一定程度的激活,但 是对突变体则没有这种作用。非极性表面活性剂对野生型有部分抑制作用 而对突变体无影响。另外,极性表面活性剂对二者几乎都完全抑制。


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