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细胞内Ca~(2+)浓度、氧化应激、骨桥蛋白在氟中毒肾损害发生发展中的作用及氟中毒大鼠肾组织蛋白质组研究

徐辉  
【摘要】:肾脏是氟的主要排泄器官,当机体摄入过量氟超过肾的排泄能力时,肾组织细胞就会因处于高氟环境而受到损害。文献中有关过量氟导致的肾损害,除剂量很大时可引起大鼠肾小管扩张及间质纤维化外,还有中、低剂量造成的近端肾小管上皮细胞变性、坏死及再生修复。关于氟中毒肾损害的性质、剂量-效应关系以及发生机制,目前还存在许多问题有待解决。为了更深入了解氟对肾小管的损害作用及其机制,我们应用整体氟中毒动物模型和体外肾小管上皮细胞染氟,观察不同氟浓度和钙营养条件下肾细胞形态、机能改变及氟作用于肾的剂量-效应关系。利用病理、生化、分子生物学及蛋白质组学等技术主要针对以下几方面的问题进行实验研究:1)肾小管上皮细胞在不同染氟条件下增殖活性的改变,并探讨与凋亡关系密切的bax、bcl-2基因表达的变化;2)肾细胞内游离钙变化及其与钙泵损害的关系;3)氧化应激在氟中毒肾损害机制中的地位;4)氟中毒时肾组织骨桥蛋白(OPN)的表达改变,是否对肾发挥保护作用。此外,还拟对氟中毒大鼠肾组织进行试探性蛋白质组学研究。 我们在病理切片上观察氟中毒16周大鼠在钙营养状况良好、投氟剂量不特别大时,肾损害较轻,主要是上皮细胞变性、核深染或染色质边集, 中文摘要 很少见明显坏死或间质炎症反应;用TUNEL法或流式细胞术证实细胞凋亡 增多。通过体外原代肾小管上皮细胞培养、MTT实验可见从染氟0.lmg/L 到15mg/L,细胞的增殖活性均保持不变或明显增高,只是在氟浓度达 25mg/L时,细胞的增殖活性才明显下降。且肾小管上皮细胞经过量氟处 理后bax的mRNA表达水平上升,与氟浓度的增加呈正相关;而bcl一2的 mRNA水平则随氟量的增加逐渐下降。这就促使肾小管上皮细胞朝着凋亡 的方向发展。该结果与氟对细胞增殖活性影响的变化趋势基本上一致,表 明肾小管上皮细胞凋亡是氟中毒肾损伤的一种基本方式。本文所使用的染 氟浓度虽然还不够系统和细密,有些指标还没有做到终点,但大体上也可 看出氟作用于肾小管上皮细胞的一幅全剂量一效应曲线的雏形。 在实验中我们检测了一系列钙代谢的相关指标,发现常食投氟组大鼠 血清总钙和离子钙变化不大,而暴露于低钙高氟环境中的大鼠血清总钙降 低,离子钙降低达到显著程度。同时可见低钙条件下氟中毒大鼠肾脏病变 不象富钙条件下以细胞凋亡为主,而是较严重的肾小管上皮细胞变性、坏 死,甚至在个别大鼠出现肾小管病理性扩张。这些说明低钙和高氟在体内 起着相互加重的作用。并观察到低钙饲料喂养的氟中毒大鼠肾细胞的 Ca2+一ATPase活性较富钙饲料喂养者下降。在此基础上用不同浓度氟处理 肾小管上皮细胞观察钙泵的活力,发现低浓度氟(1一smg/L)对钙泵是正 性作用,Ca2+一ATPase活性升高;但随着氟浓度的提高(妻7.smg/L), Ca2+一ATPase活力明显下降。从而看出氟水平较低时可促进细胞钙泵活力, 呈现刺激作用,符合“hormesiS”现象;但在高氟水平则细胞钙泵活力 下降明显,可导致胞内钙储留,体现了氟的毒性作用。 利用生物化学方法检测氧化应激指标,结果表明在钙营养充分的条件 下,投氟100mg/L16周大鼠肾组织GPx活性不是下降而是明显提高,脂 质过氧化物变化不明显;低钙饲养条件下投氟10Omg/L16周大鼠抗氧化 了 .夕。 中文摘要 酶SOD活性亦有明显升高,而GPX却呈降低趋势。并在细胞水平观察到随 投氟量的增加染氟24小时肾小管怎皮细胞MDA含量呈下降趋势,抗氧化 酶SOD、CAT活性显著升高;而在氟处理72小时肾小管上皮细胞SOD活性 较之相同投氟量24小时时间段下降。综合本实验结果和我们实验室以往 多次检测情况来看,使用传统的氧化应激指标(如MDA、GPx、SOD、CAT 等)其结果不甚一致。大体上明显的氧化应激态多出现在实验周期长或投 氟剂量大的情况下,看来氧化应激无疑参与了氟中毒肾损害的发生机制, 但不象是始动环节,更不会是唯一的机制。我们的实验还表明,Bd一2表 达下调和NO产生增多在造成氧化应激态中的作用值得重视。 我们对正常和投氟大鼠肾组织进行OPN蛋白表达情况观察,通过图象 分析软件对OPN表达的平均灰度进行分析,证明氟中毒大鼠的OPN表达明 显增强,而且饲低钙饲料的大鼠肾皮、髓质OPN抗体着色无论是面积还是 深度都较其他各组强。联系实验中肾细胞损伤情况都是在低钙偏食投氟组 最为明显,且病变最明显的是肾小管上皮细胞,这都与OPN的表达情况相 吻合,表明OPN与氟中毒肾脏损伤有着一定联系。利用分子生物学技术对 大鼠肾OPN mRNA表达进行观察,虽然各组差异未达到显著程度,但投氟 组的表达仍然较强,与OPN蛋白表达是吻合的。我们还观察原代培养肾小 管上皮细胞在不同浓度氟作用下各种指标变化与O刚mRNA水平的关系, 证实OPN mRNA水平随着氟浓度的升高而提高,与促凋亡基因bax mRNA 水平变化相一致,而与抗凋亡基因bcl一2相反。这似乎说明虽然氟促使肾 细胞向凋亡方向发展,但OPN表达仍在增强,仍发挥其保护作用。 基质


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