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《吉林大学》 2004年
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U_1小核核糖核酸嵌合体核酶靶向抑制HCV表达的研究

王美霞  
【摘要】:丙型肝炎是当今严重威胁人类健康的疾病之一。世界上约有1%人口感染HCV,我国人口感染率约为3%。其难治的一个重要原因在于极易慢性化(85%以上),其中有20-40%发展为肝硬化、肝功能衰竭甚至肝细胞癌,严重危害了人类健康。 早在1989年Choo等建立了HCV RNA的cDNA文库从而确定了HCV存在以前人类就不断探索着一种能抑制HCV感染的方法。到目前为止。IFN-α被认为是治疗丙肝最有效的药物,但仅有20-30%病人对干扰素治疗获得持久应答;新近用干扰素联合利巴韦林持久应答率也只提高到40%,疗效远不能令人满意。为此,需要找到一种更有效的抗HCV方法。在抗HCV药物的开发筛选中,由于缺乏HCV复制细胞系以及小动物模型,使得这一进程进展缓慢。 基因治疗为HCV感染带来了希望。其中研究的热点之一是核酶用于抗病毒治疗。核酶是一种具有催化作用的小RNA分子,能与特异性RNA以碱基配对方式结合并使其在特定核苷酸部位发生裂解。在所有核酶形式中,锤头样核酶是最小最有特异性的,被研究得也最多。锤头样核酶由催化活性中心(22nt,裂解靶RNA)和两侧的侧翼部分(与靶RNA以碱基配对特异性结合)组成,其识别序列为NUX三联体,其中N为A,C,U或G中任一碱基,X为A、C或U。反应条件要求在生理温度下,有Mg2+(10mM)存在时。大量的研究工作证实不论在体内或体外核酶确实能特异地切割靶RNA。但在实际应用中人们逐渐发现其不足。例如,由于细胞内RNA各自有特殊定位,病毒RNA在细胞内也是严格地隔室化分布,所以核酶在细胞内与底物不能象在试管内那样自由有效地接触并反应,从而降低了其切割效率;在细胞内环境中核酶活性会发生变化;在体外表达产物众多且具催化活性的核酶在细胞内可能没有活性;且未经修饰的核酶在细胞内和血清中都可能不稳定等。另外,为提高核酶的表达和稳定性所采取的一些策略又会干扰 WP=90 其催化活性。这些原因使得核酶在体内的抗病毒作用受到了极大限制。 要使核酶在体内同样高效地发挥作用必须找到有效的载体。这种载体应该具有下列四种重要性质:①能高水平表达;②具有高度稳定性;③具有活性结构;④在细胞内能正确定位。 存在于真核细胞核中的U1小核核糖核酸(U1snRNA)正是这样一种较为理想的载体。它是一种小分子量RNA,具有酶活性,主要参与核内非均一性RNA(包括mRNA前体)的剪接成熟过程,且只定位于核质中。其序列具有高度保守性(95%)。人类U1snRNA由163nt组成,具有m3G帽和四个茎-环结构。体内每分子U1 snRNA都是与7~8种蛋白质结合成小核核糖核蛋白体(snRNP),以RNP的形式存在和执行功能。到目前为止,人们已成功地利用U1snRNA作载体构建出U1嵌合体核酶(U1-Rz),并成功地在体外或细胞内切割了HIV-1 mRNA前体等。Alessandro Michienzi等在以U1-Rz切割HIV-1实验中得出如下结果:①无论细胞内外U1-Rz对HIV-1 RNA都显示出高效切割活性;②U1-Rz中的U1 snRNA在细胞内能形成U1 snRNP,但效率较野生型U1为低。这两个事实向我们提示:U1嵌合体核酶中U1与核酶二者对对方的活性功能都没有显著影响。 前人的研究中都是针对mRNA前体设计了U1嵌合体核酶。我们设想以HCV作为靶标。因为HCV是RNA病毒,其基因组既可作为模板复制出子代RNA,同时又起mRNA的功能指导翻译病毒蛋白。这样,针对HCV RNA的特异U1-Rz就可在复制和翻译两个水平上抑制病毒。故我们以人类U1 snRNA作载体,将核酶序列替代了它的第三个茎-环区,构建出U1核酶嵌合体的原核及真核表达载体。选择该区作为替代区域是因为它不影响U1 snRNA在核内的准确定位及核内稳定性。嵌入的核酶序列裂解位点在HCV基因组核心(C)区,第381位之后。HCV的高度易变已成共识,但相对而言,其5’非编码区(5’-NCR)与核心区上游具有相对保守性。所以我们选择C区作靶点,这样可保证所构建U1-Rz对绝大多数HCV毒株有作用。同时,我们以同序列的单独核酶作为对照,以观察二者在细胞内外对HCV RNA WP=91 切割效率的差异。该试验的作用底物为HCV NCR和部分C区基因,它与荧光素酶基因(luc)构成了融合基因,插入到真核表达载体pCMV/T7中。以luc表达的荧光素酶作为报告基因。先将携带U1-Rz、核酶及HCV基因的质粒pGEM-(U1-Rz)、pGEM-Rz 及pCMV/T7-NCRCΔ-luc在体外转录,其中NCRC△-luc RNA以[α-32P]UTP标记;然后U1-Rz及核酶RNA分别与靶RNA混合,研究不同体积比和作用时间下二者对底物的切割效率,并在二者的效率之间进行比较。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影发现U1-Rz RNA能较高效地裂解HCV RNA,与相同序列的核酶相比二者之间没有明显差别。二者的切割效率随着作用时间延长、核酶:靶RNA的比例增大而增加。进一步以U1-核酶嵌合体以及核酶的真核表达载体pcDNA3.1(+)U1-Rz、pcDNA3.1(+)Rz分别pCMV/T7-NCRCΔ-luc通过脂质体介导共转染人肝癌细胞Huh7,在转染后48小时刮取细胞,制备细胞裂解液,取上清进行Western Blot及利用荧光素发光检测仪FLX800进行检测,结果发现pCMV/T7-NCRCΔ-luc能够在Huh7中表达荧光素酶,与阳性对照荧光素酶表达载体pGL3相比其产生荧光的量较少,可能是因为前者中荧光素酶的表达受到插
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R346

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