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《吉林大学》 2004年
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实验性脑出血的神经组织损伤和保护

张尉华  
【摘要】:研究背景和目的 ICH是神经系统的临床常见病,起病急、预后差,病死率和致残率均较高。近年来随着我国经济的发展和人民生活水平的提高,出血性脑卒中在我国的发病率有逐渐提高的趋势,而且平均发病年龄也趋于年轻。ICH一般都会导致神经功能的严重缺损,大量的和/或重要生命中枢部位的ICH可导致患者在急性期死亡,存活的患者常遗留肢体运动、感觉障碍和语言、情感等高级神经功能受损,导致患者残疾,严重的影响寿命和生活质量。目前临床上还缺乏有效的手段治疗ICH,减轻ICH导致的神经功能缺损。现在的脱水降颅压治疗或外手术清除血肿虽能挽救危重患者的生命,但难以取得满意的远期疗效。研究表明,ICH后的神经组织损伤不仅仅是因为血肿的占位效应及其对周围脑组织的直接破坏,继发性神经损伤也是加重神经功能缺损的重要原因。ICH后的直接和继发性损伤均可导致神经细胞的变性、死亡,从而造成神经功能的缺损。本实验对ICH后的神经病理损伤和可能的保护机制进行研究,从而进一步明确ICH后的组织和细胞病理变化,为临床上进一步研究ICH的治疗方法提供实验理论依据。 实验方法 通过向体重为250-250g健康雄性大鼠尾壳核区(前囟前0.2mm,中线旁开4mm,垂直进针5.5mm)注入自体非肝素抗凝动脉血50μl,制作大鼠实验性ICH动物模型,分别在术后6h、12h、24h、2d、3d、5d和7d处死动物,取脑。分别HE、亚甲蓝、LFB、PTAH染色和电镜观察ICH WP=75 后的病理变化,MAP-2、GFAP免疫组化染色观察ICH后的细胞骨架损伤,应用TUNEL标记、流式细胞仪检测、DNA电泳观察细胞凋亡,bcl-2、bax、caspase-3和TNF-α免疫组化染色观察凋亡相关蛋白的表达。上述实验动物模型基础上,注血后10min向血肿中心注入20μl重组水蛭素生理盐水溶液(含水蛭素100U),制成水蛭素干预组动物模型,分别1d、2d、3d和5d处死动物,取脑。分别HE染色,MAP-2、GFAP免疫组化染色,caspase-3免疫组化染色、TUNEL标记,观察对水蛭素对出血后脑组织损伤和水肿、细胞骨架蛋白以及细胞凋亡的影响。 结果 大鼠注血后的活动减少,反应较术前迟钝,部分动物可见注血对侧肢体活动不灵活,有单方向转圈运动,严重者肢体完全偏瘫而无法活动。大体病理可见尾壳核区类圆形血肿。2-3d组可见血肿周围脑组织肿胀,侧脑室前角受压。镜下可见血肿形成后24h以内边缘灶脑组织软化。血肿周围组织水肿,神经细胞、胶质细胞肿胀,细胞间隙出现大小不等的空泡,部分神经细胞坏死、消失。3d组的组织水肿和细胞间隙空化最为明显。亚甲蓝染色可见神经细胞核周和胞浆尼氏体减少、消失。血肿周围可见神经细胞固缩,核浓染。毛细血管扩张、充血,管壁肿胀,周围可见中性粒细胞浸润。PTAH和LFB染色可见神经纤维和髓鞘断裂、排列紊乱,血肿周围区域染色变浅、消失。血肿形成24h后,开始逐渐吸收,可出现胶质细胞增生,小胶质细胞吞噬脂质形成格子细胞,部分小胶质细胞内存积含铁血黄素,常聚集成片位于血管周围。各组标本在针道处可见组织缺损,中性粒细胞浸润和胶质增生。电镜下的病理变化:对照组神经细胞超微结构正常,核呈圆形,染色质分布均匀,核仁清晰,胞浆中包含形态正常的高尔基体、粗面内质网和丰富的线粒体,毛细血管形态、结构完整。实验组神经细胞肿胀,部分神经细胞膜及核膜连续性破坏或局部破损。损伤严重者核固缩,染色质凝集成块状或核呈溶解状。变性神经细胞胞浆模糊不清,有些胞浆内可见空泡形成,线粒体肿胀呈空泡状,嵴断裂。可见神经细胞核固缩,粗面内质网扩张、脱颗粒,多 WP=76 聚核糖体解聚。星形胶质细胞亦明显肿胀,内质网扩张明显,线粒体肿胀,线粒体嵴模糊、消失,胞质基质明显变淡,核基质疏松。神经毡明显疏松,可见大量细胞突起肿胀,髓鞘板层松散,受损的突触结构有不同程度的肿胀。上述病理变化随着血肿形成的时间延长而逐渐严重,至3d达到最明显,而后逐渐减轻。MAP-2、GFAP免疫组化染色结果表明,对照组MAP-2广泛存在于神经元的突起部分,呈条索状,突起细直显色明显,胞体显色略淡。实验组MAP-2突起弯曲,呈类串珠样或增粗;MAP-2染色变浅,神经细胞呈空泡状,神经细胞部分坏死。树突破坏、断裂。对照组胶质细胞丝极完整清晰,伸展自然。实验组的反应性坏死区,GFAP呈强阳性反应,星形细胞的簇样增生,胶质细胞丝极肥大、增粗。有丝极断裂现象,严重者丝极完全消失。Bcl-2、bax、caspase-3、TNF-α免疫组化染色和TUNEL标记结果表明,血肿形成后,周围组织bcl-2阳性细胞数逐渐下降至1d达到最低,而后升高;bax、caspase-3、TNF-α以及TUNEL阳性细胞数逐渐上升,分别至1d-2d、2d-3d、3d和3d-5d达到峰值,而后降低。caspase-3 mRNA的表达在2d达高峰。流式细胞仪检测结果表明,血肿形成后各时间点血肿壁组织细胞流式细胞仪细胞周期检测均可见G1峰前形成一个DNA含量降的Ap亚峰,Ap亚峰细胞数占细胞总数的比例逐渐增加,在5d形成高峰。DNA电泳结果表明,2d-7d组可见断裂DNA片段形成的不典型梯形条带。水蛭素干预实验结果表明,血肿周围的细胞坏死和组织水肿明显减轻。MAP-2免疫组化染色较对照组阳性细胞数量多,染色深,串珠样变
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R743.3

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