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《吉林大学》 2004年
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hBMP-2基因腺病毒表达载体体内外成骨的实验研究

韩冬  
【摘要】:BMP是一组分泌型蛋白质,由于其肽链C-末端的半胱氨酸具有高度同源性,因而属于转化生长因子β超家族成员(TGF-β)。BMP在体内能够趋化、聚集间质干细胞,使其增殖、分化为成软骨细胞和成骨细胞,从而启动成骨的级联过程。随着分子克隆技术的出现,高度纯化的rhBMP被生产出来,从而对BMP的理化性质、成骨机制和临床应用前景有了更加深入的了解。但是,使用外源性rhBMP存在着缺乏合适的承载体,在体内降解较快,生物活性时间短等缺点。近几年来,随着基因载体系统和转移技术的日益完善,学者们开始尝试着将BMP基因导入到骨损伤部位,使具有更高生物活性的BMP在损伤部位持续、稳定表达,从而达到治愈骨科疾病的目的。其中,BMP-2具有较强的成骨诱导活性,显示了广阔的临床应用前景。由于腺病毒载体不整合到宿主细胞的染色体中,从而具有更大的安全性和非长期表达的特点,这正适合骨科疾病短期治疗的需要,加之腺病毒载体具有很高的转染效率而被学者们广泛采用。BMSC位于骨髓的基质细胞系中,分裂增殖能力强,可分化为成骨和成软骨等多种结缔组织细胞,易于被外源基因转染且表达稳定,是基因治疗的理想靶细胞之一。成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞,在体内分布广泛,取材方便,易行培养,分裂增殖迅速,是骨折后参与纤维骨痂阶段的主要细胞成分,因此也是一种比较理想的种子细胞。 本实验在成功构建AdBMP-2的基础上,在体外实验部分,探讨了AdBMP-2分别转染兔BMSC和小鼠L929成纤维细胞后对其生物学变化的影响,hBMP-2基因在mRNA水平与蛋白质水平的表达情况以及两种细胞经AdBMP-2转染后是否向成骨细胞方向分化及其分化机制。在体内实验部分,采用了In vivo的方法,将AdBMP-2直接注射到裸鼠后肢肌群,评价AdBMP-2 WP=124 的成骨能力,并探讨AdBMP-2在体内诱导成骨的机制和利用基因转移技术构建组织工程骨的可行性,从而建立一个利用AdBMP-2构建组织工程骨的方法。 在本实验中,采用了密度梯度离心法和贴壁法自兔胫骨骨髓中获得了原代BMSC,并经多次传代进一步纯化后,应用AdBMP-2病毒液转染BMSC(MOI=100),MTT法和流式细胞仪等检测转染后细胞生物学变化,并在同等条件下转染Adβgal以确定其转染效率。AdBMP-2转染兔BMSC后7d,采用原位杂交和免疫组化法测定hBMP-2基因在mRNA水平及蛋白质水平的表达;采用原位杂交法检测Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和VEGF等mRNA的表达;免疫组化法检测OC和Ⅱ型胶原的蛋白质表达;钙钴法检测细胞内ALP的表达。同时,又选取了小鼠L929成纤维细胞系对AdBMP-2的成骨能力进行了评价,AdBMP-2病毒液转染小鼠L929成纤维细胞系(MOI=100),采用MTT法和流式细胞仪检测转染后细胞生物学变化,同等条件下转染Adβgal以确定其转染效率。AdBMP-2病毒液转染小鼠L929成纤维细胞7d后,采用原位杂交和免疫组化法测定hBMP-2基因在mRNA水平及蛋白质水平的表达;采用原位杂交和免疫组化法法检测Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和VEGF等mRNA水平和蛋白质水平的表达,免疫组化法检测OC的蛋白质表达,钙钴法检测细胞内ALP的表达。在体内实验部分,用微量注射器抽取AdBMP-2病毒液(滴度为2×1012pfu/ml)30μl,分别注射到裸鼠左后肢一侧股四头肌和胫骨前肌处,注射后20d、30d、60d取材,大体观察、X线片、组织学、免疫组化和原位杂交等方法评价AdBMP-2的体内成骨能力并分析其成骨机制。Adβgal(滴度2×1012pfu/ml)30μl对侧右后肢腓肠肌内注射,注射后20d、30d和60d取材观察作为对照。Adβgal(滴度为2×1012pfu/ml)30μl裸鼠右后肢腓肠肌内注射,3d后取材,X-gal组化染色检测βgal的表达以确定转染细胞类型。 经AdBMP-2转染后的BMSC增殖能力未见明显改变,hBMP-2基因在mRNA WP=125 水平和蛋白质水平都获得了强阳性表达;细胞合成Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、VEGF、OC及ALP的能力都明显增强;空白对照组细胞极少见阳性表达;X-gal免疫染色显示Adβgal的转染效率接近100%。同样,经AdBMP-2转染后的成纤维细胞的增殖能力也未见明显改变,hBMP-2基因在mRNA水平及蛋白质水平表达强阳性;细胞合成Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、VEGF、OC及ALP的能力明显增强;空白对照组细胞极少见阳性表达;X-gal组化染色显示Adβgal的转染效率接近100%。在裸鼠肌肉内直接注射AdBMP-2后20d,大体观察到左后肢注射部位软骨性和骨性隆起,较对照侧粗重,X线片下见注射部位出现高密度钙化影像,组织学观察到肌组织内软骨化骨有少量编织骨形成,原位杂交法显示间质单核细胞,软骨细胞,成骨细胞、骨细胞及周围肌肉hBMP-2、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原表达阳性;软骨细胞,间质单核细胞、成骨细胞和血管内皮细胞VEGF表达阳性,免疫组化法显示hBMP-2、Ⅱ型胶原和OC等强阳性;AdBMP-2注射后30d,注射部位骨性隆起增大,X线片下见注射部位高密度钙化结节增大,组织学观察到肌内继续软骨化骨,编织骨组织增多,并有少量板层骨形成。原位杂交法显示骨组织及周围肌肉hBMP-2、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原表达仍阳性,成骨细胞和血管内皮细胞VEGF表达阳性,免疫组化法显示hBMP-2、Ⅱ型胶原和OC等阳性;AdBMP-2注射后60d,注射部位骨性隆起较以前未明显增大,X线片下见注?
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R687

【参考文献】
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【二级参考文献】
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