UT-B基因突变家族的基因型分析、家系调查及相关研究

【摘要】：尿素通道蛋白（Urea Transporters，UTs）是介导尿素顺浓度梯度跨膜转运的膜蛋白，在尿液浓缩功能中具有重要作用。目前，已克隆出哺乳动物的UTs包括UT-A、UT-B两个家族，分别由slc14α2基因和slc14α1基因编码，串联在染色体18q12-21上。UT-B在肾脏、心脏、脑等组织器官有表达，尤其在红细胞膜上呈高表达。UT-B蛋白在红细胞膜上又称为JK血型抗原，JK抗原缺失者通常称为Jknull表型。先后在澳大利亚人、印第安人、欧洲高加索人（玻利尼西亚人、芬兰人、法国人）中报道有Jknull表型，其他人群中频率极低。尚无Jknull表型在中国分布频率的报道。Jknull表型的红细胞在2M尿素中溶血缓慢，常作为简捷而有效的筛查方法。虽然对UT-B的基因和蛋白结构的研究已经取得了显著成果，但对其生理功能研究还处于初级阶段。Jknull表型者与UT-B基因敲除小鼠是最为理想的研究对象，现已发现UT-B基因敲除小鼠由于肾脏内尿素逆流交换过程被阻断而导致尿浓缩能力显著下降，并发现部分Jknull表型患者的最大尿浓缩功能降低。对其他脏器功能是否有影响尚无报道。 目的：从患病人群中筛查出1例进展型家族性心脏传导阻滞与UT-B缺失为一体的先证者。本文目的是研究红细胞膜尿素通透性缺失的先证者及其家族成员的基因型和表型，并初步探讨尿素通道蛋白缺失与疾病的关系。 方法：（1）研究对象为应用2M尿素溶血实验筛查出的患有严重心脏传导阻滞的Jknull个体及其家族成员，对照人群为健康体检的正常人。（2）应用间接抗人球蛋白实验确定Jknull个体和其家族成员的JK表型。（3）应 WP=95 用stopped-flow light scattering方法检测其红细胞膜对尿素和水的转运速率，并对人和小鼠红细胞膜的尿素和水的转运速率进行比较。（4）应用PCR与DNA测序技术，对先证者及家族成员的基因组DNA进行分子遗传学分析。（5）对先证者及其家族成员的血、尿常规、离子、生化、肝功能、肾功能等指标进行检测，检查心电图等功能指标。（6）对该先证者及其家族成员进行回顾性病史调查，进行临床家系分析。（7）利用培养的大鼠心室肌细胞，观察UT-B的特异性抑制剂phloretin对心室肌细胞自发搏动幅度和频率的影响。（8）全细胞膜片钳技术，观察phloretin对心室肌细胞的APA、RMP等各项参数及内向整流钾电流（IK1）和L型钙离子通道的影响。 结果：（1）在2万名患病人群中仅筛查到的1例JK（a-b-）表型患者。正常人红细胞在2M 尿素溶液中立即涨溶，而Jknull患者红细胞先皱缩后膨胀，溶血速度极为缓慢。（2）红细胞膜对尿素的转运速率较正常对照降低120倍。（3）该先证者的UT-B基因测序结果证实患者UT-B等位基因的第5内含子及第6外显子交界处的碱基分别发生两个不同的突变（AGG→ACC；AGG→AAG）称为双突变杂合子，导致转录后第6外显子缺失。（4） Jknull患者的子女、姐姐UT-B基因突变为单突变杂合子（AGG→ACC；AGG），其红细胞膜分别为JK（a+b+）和JK(a-b+)表型，对尿素的转运速率正常。该家族的UT-B基因突变为常染色体隐性遗传。（5）在Jknull患者的网织红细胞，UT-B的mRNA缺失UT-B的第6外显子（126 bp），为 Jk(△6) 突变，使UT-B蛋白丧失了转运尿素的功能。（6）该Jknull先证者患进展型心脏传导阻滞(由左前半分支传导阻滞，完全右束支传导阻滞，发展为心脏完全传导阻滞)，47岁就起以搏器维持生命活动。家族调查发现该Jknull患者的家族三代9人中有6人具有与先证者类似的进展型家族性心脏传导阻滞的症状与心电图的变化。但是，其姐姐发展过程显著减慢，出现心脏完全传导阻滞的时间较先证者晚，70岁才按起搏器。（7）大鼠 WP=96 心室肌组织存在UT-B mRNA的特异性表达。（8）UT-B的特异性抑制剂phloretin（200 μM）对UT-B功能抑制后, 培养的大鼠心室肌细胞自发搏动幅度明显减弱，搏动频率明显降低。（9）phloretin对UT-B功能抑制后，培养的大鼠心室肌细胞的内向整流钾电流（IK1）和L型钙离子通道明显受到抑制。APA明显降低，RMP负值减少，导致心肌细胞的传导性和兴奋性明显降低。 结论：（1）发现UT-B基因突变与进展型家族性心脏传导阻滞（PFHB I）为一体的先证者，这在国内外都是首报； （2）?先证者及其家族UT-B的DNA分析发现第6外显子缺失，第5内含子与第6外显子连接的两个碱基发生了不同类型的突变。先证者UT-B基因突变为双突变杂合子，先证者子女、姐姐及其子女均为单基因突变杂合子，表型正常； （3）UT-B基因突变的类型与进展型家族性心脏传导阻滞发病早晚与进展速度相关。表现为单基因突变杂合子的姐姐心脏完全传导阻滞的发展速度较先证者缓慢，二者按起搏器的时间差30年，子女发病时间也较先证者晚； （4）尿素通道抑制剂-phloretin 对UT-B功能抑制后使培养的大鼠心室肌细胞自发搏动幅度明显减弱，搏动频率明显降低。 提示进展型家族性心脏传导阻滞可能是UT-B基因突变的相关表型；但是二者的关系还需进一步研究探讨，这也是本课题后续研究的重点。揭示二者的关系将会为临床上心脏传导阻滞的病因研究提供线索。

【关键词】：尿素通道蛋白 基因突变 进展型家族性心脏传导阻滞 心肌细胞 膜片钳
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R394
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